京尼平苷調控Wnt/β-cantenin信號通路抑制胃癌轉移的機制研究

王金樂 朱星蓉 夏愛丹 林銀鳳 陳斌斌 孫宏迪 謝炳壽

胃癌是一種常見的消化系統腫瘤，全球近半數胃癌新發及死亡病例均發生在中國[1]，胃癌復發轉移是導致患者死亡的重要因素之一，術后復發率＞50%，其中大部分是遠處轉移復發[2]。Wnt/β-cantenin信號通路的異常活化是胃癌發生發展的關鍵，其參與胃癌細胞的周期調控、上皮-間充質轉化（epithelia1-mesenchymal transition，EMT）等多個過程，并在一定程度上決定胃癌患者的預后[3-4]，以DKN-01、IWP-2、Rspo3為靶點的靶向藥物仍處于實驗研究階段。京尼平苷（geniposide，GEN）是一種環烯醚萜類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗血栓等多種藥理活性[5-6]，在口腔鱗癌HSC-3細胞中顯示出抗腫瘤作用[7]，還可以通過改變凋亡相關因子Bcl-2及Bax的表達進而促進宮頸癌HeLa細胞的凋亡[8]。GEN在體外和體內均顯示出對幽門螺桿菌感染的抑制作用[9]，但國內外關于GEN作用于胃癌的研究報道并不多見。該研究通過體外培養胃癌SGC-7901細胞，探討GEN對SGC-7901細胞侵襲轉移的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）細胞：人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。（2）主要試劑：胎牛血清購自美國Hyclone公司；二甲基亞砜（DMSO）購自上海凌峰化學試劑公司；乙醇購自上海吉諾試劑公司；RPMI-1640液體培養基購自美國GIBCO公司；NaCl和KC1購自上海生工生物股份有限公司；Na2HPO4和KH2PO4購自國藥集團化學試劑有限公司；LiCl購自美國Merck公司；Fibronectin（F8180）購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁生物；4%多聚甲醛購自上海博谷生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶消化液和結晶紫染色液購購自上海碧云天科技有限公司；Matrigel基質膠（354234）購自美國BD公司；反轉錄試劑盒和q-PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；兔單克隆抗體β-catenin（8480S）、鼠單克隆抗體E-cadherin（14472）、兔單克隆抗體Snail（3879S）、兔單克隆抗體Vimentin（5741）和兔單克隆抗體GAPDH（2118）購自美國CST公司；HRP標記山羊抗兔IgG（A0208）和HRP標記山羊抗小鼠IgG（A0216）購自上海碧云天科技有限公司；HRP化學發光底物購自美國Miliipore公司。（3）主要儀器：電子分析天平購自德國賽多利斯公司；化學發光成像系統購自上海勤翔科學儀器有限公司；細胞計數儀、多功能酶標儀、垂直電泳儀、Western濕轉儀購自美國BIO-RAD公司；Transwell小室購自美國corning公司；StepOne Plus實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司；小離心機購自德國Eppendorf公司；二氧化碳孵箱購自美國Thermo公司；倒置光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；熒光顯微鏡購自奧林帕斯（中國）有限公司。

1.2 實驗方法 （1）細胞培養：在含10% FBS和1% 青-鏈霉素的RPMI-1640培養基中培養人胃癌細胞株SGC-7901，培養環境為飽和濕度、37 ℃、95%空氣、5% CO2的培養箱。（2）CCK-8法測定GEN對SGC-7901細胞增殖的作用：取SGC-7901細胞接種細胞于96孔板中，每孔1×104個細胞；次日配制含0、50、100、200、400、600、800、1,000、1,200、1,400 μM GEN的RPMI-1640培養基，取100 μL上述培養基加入96孔板細胞中，每組接種3個復孔，置于37℃、5% CO2的孵箱中分別培養24、48 h；然后，將96孔板中的含GEN培養基更換為含10% CCK-8的RPMI-1640培養基，每孔100μL，繼續培養2 h，最后測定吸光度。（3） Transwell測定GEN對SGC-7901細胞遷移的作用：分別用含低、中、高劑量GEN的培養基，將濃度為2.0×106個/mL的細胞150μL加入Transwell上室，并在下室加入含纖連蛋白的RPMI-1640培養基，培養24 h，之后取出小室，并拭去上層細胞后，加入甲醇固定15 min，然后加入結晶紫染色30 min，洗去染色液后干燥。（4）Transwell測定GEN對SGC-7901細胞侵襲的作用：取 50μL預冷的基質膠稀釋液（基質膠：培養基=1∶2）加入Transwell上室，置于超凈臺內過夜風干，其余步驟同前。（5）蛋白印跡法測定β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin蛋白表達：分組處理后，進行蛋白印跡法，其中抗體配比如下，β-catenin（1∶1,000）、E-cadherin（1∶500）、Snail（1∶500）和Vimentin（1∶500）。（6）實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin的mRNA表達：分組處理后，采用TRIZOL法提取SGC-7901細胞總RNA，將基因組DNA去除后將RNA逆轉錄為cDNA，運用SYBR Green 法將得到的cDNA進行qPCR反應。采用2（-△△CT）法計算β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin的mRNA表達水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成：GAPDH，5- GGTGGTCTCCTCTGACTTCAA -3（forward） and 5- CCAAATTCGTTGTCATACCAG -3（reverse）；E-cadherin，5- CGAGAGCTACACGTTCACGG -3（forward） and 5- GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG -3（reverse）；Vimentin，5- AGTCCACTGAGTACCGGAGAC -3（forward） and 5- CATTTCACGCATCTGGCGTTC -3（reverse）；Snail，5- CAATCGGAAGCCTAACTA -3（forward） and 5- CAGATGAGCATTGGCAGCG -3（reverse）。（7）LiCl和GEN共處理SGC-7901細胞：分別設置空白組、GEN（80μM）組、LiCl（5μM） 與GEN共處理組，應用Transwell實驗檢測對胃癌細胞遷移和侵襲的作用，采用蛋白印跡法檢測蛋白表達，利用q-PCR技術檢測mRNA水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計量資料符合正態分布以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GEN對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響 根據CCK-8實驗得到GEN作用24 h對SGC-7901細胞的IC10=（165.14±10.93）μM，見圖1A；作用48 h對SGC-7901細胞IC10=（201.00±19.45）μM，見圖1B；選取40、80、160μM作為觀察GEN抑制SGC-7901細胞侵襲轉移的低、中、高劑量。

圖1 GEN對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響

2.2 GEN對胃癌SGC-7901細胞株遷移和侵襲功能的影響 GEN作用SGC-7901細胞24 h后，對照組和低、中、高劑量組穿過Transwell小室的SGC-7901細胞數分別為550個、431個、280個、145個，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2A和 2B。GEN作用胃癌SGC-7901細胞48 h后，各組穿過基質膠和小室膜的SGC-7901細胞數分別為387個、261個、139個、69個，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2A和2C。

圖2 GEN抑制胃癌SGC-7901細胞遷移和侵襲

2.3 GEN對胃癌SGC-7901細胞EMT的作用 結果顯示，低、中、高劑量組的E-cadherin蛋白及mRNA表達水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。GEN低、中、高劑量組的Vimentin蛋白及mRNA表達明顯受抑制，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3～4。

2.4 GEN抑制胃癌SGC-7901細胞Wnt/β-cantenin信號通路 與對照組比較，GEN低、中、高劑量組β-cantenin和Snail的蛋白及mRNA表達均下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖3～4。

圖3 GEN對胃癌SGC-7901細胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin蛋白表達的作用

2.5 GEN通過Wnt/β-cantenin信號通路抑制胃癌SGC-7901細胞的遷移和侵襲 給予Wnt激活劑LiCl后再給予GEN（80μM），與干預正常SGC-7901胃癌細胞比較，發現GEN抑制其遷移和侵襲的能力減弱（P＜0.01）。與干預正常SGC-7901胃癌細胞組比較，LiCl與GEN聯合處理組細胞的E-cadherin的蛋白及mRNA表達量明顯下調（P＜0.01）；β-catenin、Snail和Vimentin的蛋白及mRNA表達量明顯升高（P＜0.01），見圖5～7。

圖4 GEN對胃癌SGC-7901細胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin mRNA表達的作用

圖5 GEN與LiCl聯合處理對胃癌SGC-7901細胞遷移和侵襲的影響

圖6 GEN與LiCl聯合處理對SGC-7901細胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin蛋白表達的影響

圖7 GEN與LiCl聯合處理對SGC-7901細胞β-catenin、E-cadherin、Snail和Vimentin mRNA表達的影響

3 討論

胃癌轉移是導致患者死亡的主要原因，癌細胞的侵襲、轉移是一個復雜的過程，而遠處轉移的第一步需要完成上皮細胞-間充質-轉換（EMT），即上皮細胞失去胞間的連接性，獲得了向遠處遷移和侵襲能力。EMT過程中最主要的表現為鈣黏著蛋白由上皮型（E-cadherin）向神經元型轉化，會出現E-鈣黏著蛋白的表達量減少，而角蛋白骨架則逐漸向波形蛋白（Vimentin）轉化，導致波形蛋白的表達量增多[10]。Snail是誘導EMT過程中最重要的轉錄因子之一，能通過多種途徑調節EMT過程[11-12]。Wnt/β-catenin信號通路在胃癌的發生發展中起著重要作用，β-catenin是該通路的關鍵蛋白，有研究顯示β-catenin能夠激活Snail蛋白的合成，進而影響腫瘤的遷移和侵襲[13]。

京尼平苷是一種環烯醚萜類化合物，是中藥梔子和杜仲的主要有效成分，具有護肝利膽、鎮痛降糖、增強學習能力等作用，以梔子和杜仲為主藥的方劑已被證實具有良好抗腫瘤作用[14-15]。陰虛痰凝是胃癌發生的主要病機，而杜仲的功效以補腎滋陰為主，梔子以清利痰濕為主，與胃癌的病機相對應[16-17]。基礎研究，顯示，京尼平苷能夠抑制人口腔鱗狀細胞癌細胞[7]、宮頸癌HeLa細胞[8]以及胃癌MKN45細胞[18]的增殖，但其對于胃癌轉移的作用，還未見相關報道。

該研究通過CCK8法測定GEN對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，確定其IC10值，為排除GEN對胃癌細胞增殖的影響，確定40、80、160μM為GEN測定遷移和侵襲的實驗劑量，結果顯示GEN在體外能夠抑制胃癌SGC-7901細胞遷移和侵襲。GEN處理細胞后，通過Westernblot和q-PCR發現GEN能夠促進E-cadherin蛋白及mRNA表達，抑制Vimentin蛋白及mRNA表達，表明GEN是通過抑制EMT過程抑制胃癌細胞遷移和侵襲，進一步探索發現GEN能夠抑制EMT上游關鍵轉錄因子Snail和Wnt/β-catenin通路關鍵蛋白β-catenin的表達，而β-catenin能夠促進Snail的表達。因此，筆者認為GEN可能是通過調控Wnt/β-catenin通路抑制胃癌SGC-7901細胞的遷移和侵襲。通過用Wnt激活劑LiCl與GEN共處理胃癌細胞，發現能降低GEN抑制SGC-7901細胞遷移和侵襲的作用，并拮抗GEN誘導的β-catenin和Snail表達下降能力，并導致E-cadherin表達下調，Vimentin表達升高。

綜上所述，GEN能夠在體外抑制人胃癌SGC-7901細胞的遷移與侵襲，其機制可能是通過Wnt/β-catenin信號通路抑制EMT過程而實現的。但該研究僅通過體外細胞實驗證實GEN抑制胃癌細胞轉移的效果與機制，其在體外抑制胃癌轉移的效果以及如何抑制Wnt/β-catenin通路，均有待進一步深入探究，以期為臨床治療胃癌復發轉移提供新思路。