甘松浸膏超聲波萃取工藝的響應面法優化

包秀萍，劉煜宇，連培康，徐蘭蘭，念小魁

(1.云南瑞升煙草技術(集團)有限公司，云南 昆明 650106，2.江西中煙工業有限責任公司，江西 330096)

甘松為敗醬科植物NardostachysjatamansiDC.的根及莖[1].是受國家保護的藏藥之一，常用來作為藏醫、中醫的藥材[2-4].甘松含有大量的揮發性萜類成分如倍半萜類、三萜類、環烯醚萜類等[5-9].近年來，有研究報道，甘松的化學成分主要采用水蒸氣蒸餾萃取獲得揮發油，將其用于醫藥臨床的抗菌、鎮靜等方面的研究[10]，而在香精香料領域的研究較少.甘松具有獨特的藥草香、木香和涼香，因此，開發甘松香料浸膏在香精香料行業具有較高的應用價值和廣泛的前景.

前人針對甘松的研究主要集中在不同產地甘松原料分析和揮發油的化學成分分析，主要驗證石油醚萃取、水蒸氣蒸餾得到的揮發油在醫藥中的應用研究，但是關于甘松用于制備香料浸膏的研究較少[11-12].文中采用超聲波輔助萃取法[13-18]對甘松進行乙醇萃取，利用超聲波空化效應高效富集甘松中的醇溶性組分，提高萃取率.并通過響應面法[19-22]對萃取工藝進行優化，運用GC-MS檢測方法[23-27]檢測萃取物中的成分.為開發具有獨特香韻的甘松香料浸膏提供參考，拓寬甘松在香料領域的應用.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

試劑及原料：甘松(昆明地道中藥飲片廠)，95%酒精、丙二醇(食品級)，二氯甲烷(AR-天津市博迪化工有限公司)，無水硫酸鈉(AR-廣東汕頭市西隴化工廠).

試驗儀器：超聲波輔助萃取設備(哈爾濱申宜科技有限公司)；SHZ-3型循環水真空泵，控溫加熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)，GC/MS(HP 6890/5973)分析儀(美國Agilent公司)，同時水蒸氣蒸餾溶劑萃取裝置(SDE)(實驗室自制)，旋轉蒸發儀(Heidolph OB2000)(德國Heidolph公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

稱取粉碎的甘松原料，按照響應面實驗設計條件進行超聲波輔助萃取，萃取液合并，減壓濃縮即得甘松浸膏.

1.2.2 響應面法實驗設計

利用Box-Behnken Design (BBD)進行響應面法設計，以超聲功率A(W)、萃取時間B(min)和乙醇體積分數C(%) 3個因素為自變量，每個因素取3個水平，以-1, 0和+1編碼，以甘松浸膏的萃取率為響應值進行因素水平設計(表1).

萃取得率計算公式為：

甘松浸膏的得率(%)=甘松萃取物質量(g)/原料質量(g)×100%.

表1 實驗因素水平編碼

1.2.3 同時蒸餾萃取

取 25 g 甘松浸膏放入同時蒸餾萃取裝置一端的 500 mL 圓底燒瓶中，并加入 2 mL 內標物萘(質量濃度 100 μg/mL)，加入 250 g水后用電熱套加熱回流，裝置的另一端為 100 mL 圓底燒瓶，里面裝有 25 mL 二氯甲烷，在 60 ℃ 水浴中加熱同時蒸餾萃取 2 h.用無水硫酸鈉作為干燥劑對二氯甲烷萃取液進行干燥，置于 4 ℃ 條件下放置，二氯甲烷過濾后將濾液倒入濃縮瓶中用Vigreux柱濃縮至約 1 mL，濃縮液用于GC/MS分析備用.

1.2.4 GC/MS分析條件

毛細管柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：240 ℃；載氣：He，1 mL/min；程序升溫：升溫至 50 ℃ 保持 1 min，以 8 ℃/min 升溫至 160 ℃保持 2 min,繼續以 8℃/min 升溫至 260 ℃ 保持 15 min；進樣量：0.5 μL，分流比：25∶1；傳輸線溫度：280 ℃；電離方式：EI，電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：160 ℃；質量范圍35～455 aum.按照方法TCJC-ZY-Ⅳ-014-2012進行檢測，采用NIST14、Wiley275質譜譜庫檢索測定分析.

2 結果與討論

2.1 響應面實驗結果及分析

2.1.1 響應面實驗結果

按照響應面法的Box-Behnken Design(BBD)實驗方案進行實驗，結果見表2所示.

上述方案的15個實驗點包括12個析因點(1～12)和3個中心點(13～15)，中心點重復是為了估計整個實驗的純誤差，以甘松浸膏的得率Y作為響應面分析的響應值.

2.1.2 響應面實驗結果分析

對表2進行多元回歸擬合后，得到甘松浸膏得率(Y)對超聲功率(A)、萃取時間(B)和乙醇體積分數(C)的二次多項回歸方程模型為：

Y=-36.851 42+0.123 10×A+0.379 87×B+1.009 33×C+2.250 00E-004×A×B-3.062 50E-004×A×C+1.400 00E-003×B×C-1.004 17E-004×A2-7.826 67E-003×B2-5.729 17E-003× C2

表2 工藝優化試驗方案與結果

續表2

上述的二次回歸方程方差分析結果和回歸方程系數顯著性檢驗結果見表3所示.3因素交互作用對甘松得率的響應面分析結果見圖1～6所示.

表3 回歸方程模型的方差分析結果

圖1 超聲功率-萃取時間對得率的等值線圖 圖2 超聲功率-萃取時間對得率的響應面分析

圖3 超聲功率-乙醇體積分數對得率的等值線圖 圖4 超聲功率-乙醇體積分數對得率的響應面分析

圖5 萃取時間-乙醇體積分數對得率的等值線圖 圖6 萃取時間-乙醇體積分數對得率的響應面分析

由表3數據和圖1～6可以看出，所得的模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著，說明未知因素對實驗結果干擾很小.模型的決定系數R2為 0.994 3(>0.9)，說明該模型能夠分析甘松浸膏得率的響應值變化.模型與實際情況擬合較好，適用于分析和預測超聲波輔助萃取甘松浸膏的實際情況.

由表3可知，一次項A,B和C差異極顯著(P<0.01)，二次項A2、B2和C2均達極顯著水平(P<0.01) ，說明超聲功率、萃取時間和乙醇體積分數對甘松得率有極顯著的影響.交互項AB、AC達極顯著水平(P<0.01)，BC差異顯著(P<0.05)，說明3因素交互作用對甘松浸膏得率有顯著的影響.

2.1.3 驗證實驗

為深入驗證模型的可靠性，對最優方程條件：超聲功率 500.00 W、萃取時間 40.00 min、乙醇體積分數80.67 %(為便于應用，實際超聲波功率 500 W、萃取時間 40 min、乙醇體積分數80%)進行3次實驗.

由表4可知，經過3次實驗驗證，甘松浸膏得率的平均值為42.3%，與優化后的回歸方程得到的預測值43.2%相近，表明該模型可靠，適用于響應面法優化超聲波萃取甘松香料浸膏工藝.

表4 驗證實驗

2.2 樣品致香成分檢測結果和分析

由表5和圖7可知，經過超聲波輔助萃取，能夠有效富集甘松中的主要致香成分，經GC-MS檢測出甘松香料浸膏有67種成分，其中含量最高的是異戊酸(1 880.351 μg/g)，其次是百秋李醇(932.805 μg/g)，此外含量超過 300 μg/g 的是喇叭烯氧化物-(Ⅱ)(606.377 μg/g)、(+)-γ-古蕓烯(533.779 μg/g)、(-)-斯巴醇(498.844 μg/g)、(+)-香橙烯(319.35 μg/g)、白菖烯(313.182 μg/g).

表5 甘松浸膏致香成分分析

續表5

圖7 甘松浸膏致香成分總粒子流圖

3 結果與討論

通過響應面法優化得到的模型可靠，甘松香料浸膏的最佳超聲波萃取工藝為：超聲波功率 500 W、萃取時間 40 min、乙醇體積分數80%.通過超聲波輔助進行乙醇萃取，能夠有效富集甘松中的主要成分，其中含量最高的是異戊酸，該成分具有濃烈的氣息，經過高度稀釋后具有甜潤的果香，可用于食用香料(奶酪、水果香精)、醫藥制造(生產鎮靜催眠藥物)、煙用香料(存在于白肋煙和香料煙中可改善香煙品質)；其次是具有木香和膏香氣息的百秋李醇(用于制藥、保健品、煙用香料)和古蕓烯(用于鎮定熏香、香料調配)；以及具有涼香氣息的(-)-斯巴醇(用于制藥、香料)、藍桉醇(生產香料)、白菖烯(用于制藥、香料).

前人研究主要以非極性溶劑或蒸餾法制備得到揮發油，以白菖烯、異長葉烯為主要成分，研究其在醫藥中的作用.而本文以極性溶劑體系制備甘松香料浸膏，獲得以異戊酸、百秋李醇為主要成分的制備方法，所制備得到的甘松浸膏具有獨特的藥草香、木香香韻特征，在食品、日化、香煙中可以賦予特殊的香韻風格，打破甘松主要在醫藥臨床方面的應用，為甘松的廣泛應用奠定基礎.