丁香揮發油對水產品中易腐細菌抑制作用的影響

◎ 張思琪，韋鄒萍，邵俊楠，許澤鵬，吳明霞，薛 斌

（廣州工商學院 工學院，廣東 廣州 510850）

水產品因其獨特的口感和豐富的營養成分受到消費者的喜愛。據統計，我國2021年水產品產量總計6 693萬t，比2020年增長2.2%[1]。微生物的生長繁殖和食品內固有酶的活動是導致水產品腐敗變質的主要原因。為滿足消費者對水產品的需求，延長水產品貨架期并保持其品質是水產品市場急需解決的問題。水產品的保鮮辦法主要包括低溫保鮮、化學保鮮劑保鮮與天然保鮮劑保鮮。其中，天然保鮮劑具有天然安全、高效低毒等特點，是近幾年的熱門保鮮技術。

丁香為丁香屬落葉灌木或小喬木，主產于馬達加斯加、印度尼西亞、印度及中國的海南省和云南省[2]。丁香是藥食同源植物，丁香揮發油具有抗炎、麻醉、抗細菌、抗真菌、抗氧化和抗癌等功效[3]。研究表明，丁香揮發油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和副溶血性弧菌等病原菌有較顯著的抑制作用，但對水產品中易腐細菌抑菌作用的研究報道較少。本文以基圍蝦為實驗試材，研究丁香揮發油對基圍蝦表面易腐細菌的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

基圍蝦（平均質量30～40 g），產于廣東沿海，將購買后的基圍蝦迅速運送至實驗室，置于-4 ℃冰箱中冷凍貯藏；丁香，產于云南，常溫貯存；營養瓊脂（蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏粉3 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH調至7.3±0.2）。

1.2 儀器與設備

冰箱，美的集團有限公司；電子天平，沈陽多杰電子科技有限公司；電子萬用爐，天津市泰斯特儀器有限公司；潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；生化培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；紫外分光光度計，翱藝儀器上海有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋，江明濱江醫療設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 丁香抑菌成分的提取

稱取丁香2 g，置于1 000 mL的燒瓶中，加入適量的蒸餾水，使用玻璃棒上下攪動樣品數次，使樣品完全浸濕，并用標簽標記好樣品。用油性筆在燒杯上畫出橫線以記錄水位，把燒杯放于電子萬用爐上加熱，水沸騰后開始倒計時，沸騰一段時間后關閉電子萬用爐，期間須不時攪動樣品，并保證水位基本與標記橫線平齊。關閉電子萬用爐后，待提取液冷卻至室溫。把120目濾網對折成兩層置于漏斗上，借助玻璃棒直接將提取液過濾于容量瓶中，并定容至500 mL，得到丁香提取物[4]。

1.3.2 丁香抑菌成分提取工藝的優化

稱取丁香2 g，進行單因素實驗，研究料液比（1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85和1∶90）、提取時間（5 min、10 min、15 min、20 min和25 min）對水提法提取丁香中揮發油提取率的影響。按照1.3.1提取步驟提取[5]。

1.3.3 丁香提取物的抑菌實驗

（1）預處理。在無菌操作環境下，將基圍蝦放在0.9%生理鹽水中浸泡15 min制得菌懸液，以10倍、102倍、103倍、104倍和105倍稀釋進行接種。根據預實驗結果以稀釋103的菌懸液作為最終接種樣品濃度。

（2）抑菌實驗。抑菌實驗采用稀釋涂布平板法測定菌落總數鑒定抑菌效果。將基圍蝦分成兩組，以稀釋103的菌懸液與丁香提取物1∶1混合作為陽性對照，以稀釋103的菌懸液作為陰性對照，每組設置3個平行組進行抑菌實驗。將接種完的培養皿正置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h后測定菌落總數并分析其抑菌效果。將所獲得的的陰性組菌落用于微生物菌落分析。

（3）混合菌檢測。從蝦表面微生物的菌落提取基因組DNA，提取樣品總DNA后，根據保守區設計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用Illumina Novaseq 6000進行測序[6]。高通量測序（如Illumina Novaseq等測序平臺）得到的原始圖像數據文件，經堿基識別（Base Calling）分析轉化為原始測序序列（Sequenced Reads）。實驗原理如圖1。

圖1 實驗原理圖

（4）信息分析結果。數據通過質量過濾對引物序列進行識別閾去除得到不包含引物序列的Clean Reads，利用雙端序列拼接對每個樣品的Clean Reads進行拼接，根據不同區域的長度范圍對拼接后數據進行長度過濾，最終使用去除嵌合體法得到最終有效數據。通過劃分Feature（OTUs、ASVs）、多樣性分析、差異分析、相關性分析及功能預測，統計與分析處理各階段樣品序列得出最終樣品菌落豐富度圖，以SILVA為參考數據庫使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進行分類學注釋[7]。

2 結果與分析

2.1 測定波長的確定

由圖2可知，隨著波長的增加，丁香的吸光值有著不同程度的變化，其中丁香的吸光值在340 nm處達到頂峰，由此可得丁香提取物在340 nm波長處的靈敏度最高，可提高實驗的準確性。

圖2 丁香提取物不同波長的吸收峰圖

2.2 提取時間對丁香揮發油提取率的影響

圖3為提取溫度100 ℃、料液比1∶50的條件下，不同提取時間對丁香揮發油提取率的影響。隨著提取時間的增加，丁香揮發油提取率逐漸升高。當提取時間為15 min時提取率趨于穩定。因此，提取時間為15 min最佳。

圖3 提取時間對丁香揮發油提取率的影響圖

2.3 料液比對丁香揮發油提取率的影響

圖4為提取溫度100 ℃，提取時間15 min條件下，不同料液比對丁香揮發油提取率的影響。料液比為1∶75時提取率最高。在沸水提取的條件下，提取溶劑量越大，滲透速度和化學成分溶解速率越快，提取率越高。當溶劑達到一定量時，浸出化學物質趨近飽和。綜合考慮成本與環境因素，選擇料液比1∶75、提取時間15 min、提取溫度100 ℃的條件進行丁香揮發油的提取。

圖4 料液比對丁香揮發油提取率的影響圖

2.4 丁香提取物的抑菌效果

從基圍蝦菌懸液得到的細菌與添加丁香揮發油的菌懸液在營養瓊脂培養板上進行稀釋涂布培養18 h。由圖5可知，丁香揮發油對基圍蝦表面的易腐細菌具有良好的抑菌效果。由圖6可知，對照組菌液總數分別為 3.9×105CFU·mL-1和 4×105CFU·mL-1，實驗組 a的菌落總數為1.3×105CFU·mL-1，實驗組b的菌落總數為1.8×105CFU·mL-1。經丁香揮發油作用后，培養基中混合菌的菌落總數差異顯著（P＜0.05），丁香揮發油對基圍蝦表面易腐細菌有顯著的抑制作用。

圖5 丁香提取物對混合菌的抑菌效果圖

圖6 丁香提取物對混合菌細菌總數的影響圖

2.5 微生物分離鑒定

通過統計數據處理各階段樣品序列數目，評估數據質量。由表1可知，從樣品中分離出10種微生物，其中變形菌綱微生物占樣品中微生物的96.93%。根據堿基識別與國內外文獻進行比對，結合SILVA數據庫，將10種微生物鑒定到種的水平，如圖7。

表1 混合菌菌類豐富度表

圖7 混合菌菌類名稱圖

3 結論與討論

研究發現，當丁香以1∶75料液比進行15 min的沸水提取，對基圍蝦表面易腐細菌有顯著的抑制作用（P＜0.05）。水產品營養豐富，脂肪含量低，蛋白質含量高，易成為微生物天然的培養基。一些易腐微生物的生長是引起水產品腐敗的主要原因。丁香作為一種具有抗炎、抗細菌、抗真菌的食藥同源植物，是研究開發天然保鮮劑的良好選擇。丁香揮發油可能是作用于細菌的細胞膜，改變其通透性，使得細菌因細胞膜的完整性被破壞達到抑制細菌生長的作用，進而達到水產品的保鮮作用。本實驗為丁香揮發油的提取以及其應用于食品的防腐保鮮提供了數據及理論參考。