液相色譜-質譜/質譜法測定茶葉中滅螨醌 和羥基滅螨醌殘留量的分析方法

◎ 李 苗，代 菲，金 萍，丁洪流，秦孟姣

（1.蘇州市產品質量監督檢驗院，江蘇 蘇州 215104；2.SCIEX亞太技術支持中心，上海 200335）

茶作為我國的傳統飲品，也是世界三大飲料之一[1]。據科學測定，茶葉中含有兒茶素類、咖啡堿、茶多酚、維生素和礦物質等多種成分，不僅對多種疾病有治療作用，而且有良好的延年益壽、抗老強身的作用。茶樹種植過程中出現的蟲害種類較多，螨類較多時對茶葉產量和品質都有嚴重影響，從而造成經濟損失。很多茶農會噴灑農藥以防治病蟲害，但茶葉易吸附農藥。大多數茶葉都含有一定量的農藥，只要農藥殘留量低于國家標準規定的限量，就是安全的產品。滅螨醌作為觸殺性殺螨劑，《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）[2]中滅螨醌（滅螨醌與其代謝物羥基滅螨醌之和）限量為0.01 mg·kg-1。本實驗參照《出口食品中滅螨醌和羥基滅螨醌殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》（SN/T 4066—2014）[3]中前處理方法，采用液相色譜-質譜/質譜法對茶葉中滅螨醌和羥基滅螨醌殘留量進行測定，并對該方法檢測的準確性進行確認。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滅螨醌標準品、羥基滅螨醌標準品（美國A Chemtek公司）；乙腈、丙酮、甲醇、正己烷、甲酸和乙酸銨（色譜純，美國Merck公司）；實驗室用水為Milli-Q超純水一級水；氯化鈉（分析純，國藥集團試劑有限公司）；弗羅里硅固相萃取小柱（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

I-Class液相色譜儀（美國Waters公司）；Qtrap 6500串聯質譜儀（美國AB Sciex公司）；電子分析天平（0～120 g，英國梅特勒-托利多公司）；渦旋混合儀（IKA）；氮吹儀（杭州奧盛儀器）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品提取

稱取2.5 g茶葉于50 mL離心管中，加入5 mL水、0.02 mL甲酸后，放置0.5 h。加入15 mL甲酸-乙腈溶液，高速勻漿1 min，加入2 g氯化鈉，漩渦混勻，離心5 min，吸取上層有機相于25 mL容量瓶中。殘渣中加入10 mL甲酸-乙腈溶液，重復提取一次，合并上層有機相并定容至25 mL。轉移5 mL有機相至試管中，在40 ℃條件下，氮吹濃縮至近干，待凈化。

1.3.2 樣品凈化

以2 mL弗羅里硅土柱洗脫液分兩次洗滌試管中殘留物并全部轉入活化后的弗羅里硅土固相萃取柱中，待溶液全部流出后，加入10 mL洗脫液洗脫，收集全部洗脫液，于40 ℃氮氣吹至近干，用乙腈溶解并定容至1 mL，過膜，測定。

1.3.3 標準物質配制

分別精密稱取滅螨醌和羥基滅螨醌標準物質1.0 mL于100 mL容量瓶中，甲酸-乙腈溶劑溶解并定容至刻度，搖勻，配制成1.0 μg·mL-1混合標準液。稱取一定質量的陰性樣品，按照上述前處理方法制備空白基質溶液。準確吸取滅螨醌和羥基滅螨醌混合標準液適量，用空白基質提取液將其稀釋為標準系列工作溶液，臨用時配制。

1.3.4 儀器條件

（1）液相色譜參考條件。色譜柱：ACQUITY UPLC C18柱；柱溫：30 ℃，進樣量：2 μL；流動相：A為10 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

（2）質譜/質譜條件。離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；電噴霧電壓：4 500 V；離子源溫度：400 ℃；監測離子對、定量離子對、駐留時間、去簇電壓及碰撞能見表2。

表2 監測離子對、定量離子對、駐留時間、去簇電壓及碰撞能表

2 結果與分析

2.1 線性關系

準確移取滅螨醌和羥基滅螨醌標準物質溶液，用基質空白提取液逐級稀釋成濃度為2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、25 ng·mL-1和 50 ng·mL-1的系列混合標準溶液，上機測定。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析。線性相關范圍、線性方程和相關系數見表3，滅螨醌和羥基滅螨醌線性范圍較寬，線性范圍內線性關系良好。依據標準《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[4]，應滿足R≥0.98，本實驗滿足要求。

表3 線性范圍、相關系數及線性方程表

2.2 定量限

稱取陰性樣品2.5 g于離心管中，加入濃度為25.0 ng·mL-1滅螨醌和羥基滅螨醌標準工作液0.500 mL，制備含滅螨醌和羥基滅螨醌的濃度為5 μg·kg-1的待測試樣，經提取和凈化后待測液濃度為2.5 ng·mL-1。待測液上機，進樣2 μL，進行色譜分析。根據上機結果，逐級稀釋待測液濃度，直到信噪比值約為10，即為定量限。

滅螨醌和羥基滅螨醌的色譜圖見圖1。滅螨醌的定量限為4 μg·kg-1時，信噪比為S/N=10.4；羥基滅螨醌的的定量限為2 μg·kg-1時，信噪比為S/N=10.2。S/N≥10時表明方法定量限驗證結果能滿足標準要求[5]。因此，滅螨醌的定量限為4 μg·kg-1，羥基滅螨醌的定量限為2 μg·kg-1，滿足標準要求。

圖1 滅螨醌和羥基滅螨醌色譜圖

2.3 加標回收率實驗

稱取2.5 g陰性樣品9份，分成3×3組分別進行加標，使樣品中滅螨醌和羥基滅螨醌的濃度為5 μg·kg-1、20 μg·kg-1、80 μg·kg-13 個 梯 度， 按 照 1.3.1 和 1.3.2進行樣品處理，滅螨醌和羥基滅螨醌的最終濃度為2.5 ng·mL-1，10.0 ng·mL-1，40.0 ng·mL-1， 上 機。 通過標準工作曲線得到滅螨醌和羥基滅螨醌的濃度，計算回收率，見表4?；厥章蕿?1.6%～97.4%，結果準確可靠，可滿足茶葉中滅螨醌和羥基滅螨醌的測定要求（被測組分含量＜0.1 mg·kg-1時，回收率范圍為60% ～ 120%[6]）。

表4 滅螨醌和羥基滅螨醌的回收率表

2.4 精密度實驗

稱取6份陰性樣品各2.5 g，向陰性樣品中加標，按照1.3.1和1.3.2進行樣品處理，樣液中滅螨醌和羥基滅螨醌的濃度為10 ng·mL-1。根據滅螨醌和羥基滅螨醌的峰面積響應值，計算相對標準偏差。RSD為1.92%～2.39%，精密度滿足相關要求，具體見表5。

表5 滅螨醌和羥基滅螨醌精密度表

3 結論

在實驗室日常檢測工作中，APCI源涉及的檢測項目較單一，而ESI源具有良好的通用性，且溶劑使用量較少，本實驗的液相色譜-質譜/質譜法通過ESI源代替APCI源檢測滅螨醌及羥基滅螨醌，不僅線性良好、準確可靠、靈敏度和精密度高，而且在大批量檢測任務中，可節省更換離子源環節的時間，延緩儀器使用壽命，提高檢測效率，為今后檢測茶葉中的滅螨醌和羥基滅螨醌含量提供了科學參考。