藤茶總黃酮提取工藝優化與抗氧化 活性物質基礎研究

◎ 許陳思菡，沈周媛，袁琢越，路 璐，向延衛，丁 越

（上海中醫藥大學，上海 201203）

藤茶，學名顯齒蛇葡萄，由被子植物門木蘭綱蕓香目葡萄科蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）的嫩莖葉加工而成，盛產于我國湖北、湖南、江西以及福建等南方各地[1-2]。藤茶性涼，味甘淡，有清熱解毒、消腫利咽、消癰散結的功效，可用于治療口腔潰瘍、咽喉腫痛、感冒發熱、濕熱黃疸、目赤腫痛和癰腫瘡癤等癥狀[3]。現代研究表明藤茶具有較好的抗氧化、抗腫瘤、抗炎抑菌、抗流感、降血壓、降血脂及保肝等多種保健功效和藥理作用，是一種極具開發潛力的中草藥[4-10]。黃酮類化合物是藤茶中最主要的成分，藤茶中的黃酮含量是目前被研究的植物中最高的，因此藤茶又被稱為“黃酮之王”[11]。藤茶中總黃酮含量高達45.52%，其中二氫楊梅素的含量達藤茶總黃酮含量的58.10%～58.80%[12]。目前，藤茶產品開發尚處于初級階段，以茶類產品為主，即沖泡型商品。然而藤茶曬干后，其表面的白霜會導致沖泡后外觀及口感不佳。從藤茶的開發利用來講，藤茶提取物應用到食品中安全健康，具有廣闊前景。本研究采用紫外分光光度計法檢測藤茶及其提取物中總黃酮含量，并對藤茶的水提工藝進行優化，測定藤茶提取物及其主要活性成分的抗氧化活性，研究藤茶的抗氧化的物質基礎，以期為藤茶的進一步研究和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶原茶，市售湖南張家界野生特級藤茶（批號：20210816）。

1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH），購自上海鴻永生物科技有限公司；蘆丁標準品（純度92.6%，供UV檢測），購自中國食品藥品檢定研究院；抗壞血酸（維生素C），購自國藥集團化學試劑有限公司；二氫楊梅素標準品（純度98.38%，供HPLC測定）、楊梅素標準品（純度99.69%，供HPLC測定）、檞皮素標準品（純度98.05%，供HPLC測定）、橙皮素標準品（純度98.60%，供HPLC測定）和芹菜素標準品（純度98.03%，供HPLC測定），均購自上海鴻永生物科技有限公司。乙醇、甲醇、硝酸鋁、氫氧化鈉和亞硝酸鈉均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

JFSD-100-II微型高速粉碎機，上海嘉定糧油儀器有限公司；YH系列電熱器，500 mL，江蘇近湖鎮教學儀器廠；DK-S24電熱恒溫水浴鍋，上海精密實驗設備有限公司；XS105電子天平，梅特勒-托利多集團；UV2550紫外分光光度計，日本島津公司；酶標儀，BioTek；SB5200D超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藤茶總黃酮水提工藝研究

（1）提取方法。取50 g藤茶，加入適量的水煎煮，合并幾次水煎液，過濾。

（2）單因素實驗設計。取50 g藤茶，分別加入不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50（g∶mL）的水煎煮1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h，煎煮1、2、3次，合并水煎液，過濾，采用直接測定法測定藤茶水煎液中藤茶總黃酮的濃度，并計算總黃酮提取率，考察不同料液比、不同提取時間、不同提取次數對藤茶總黃酮提取率的影響。

（3）水提工藝正交試驗設計。采用L9(34)正交試驗表，考察料液比（1∶20、1∶30、1∶40）、提取時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h）和提取次數（1次、2次、3次）3個因素，以總黃酮提取率為考察指標，分別采用直觀分析和正交分析進行水提工藝條件的優選，確定最佳水提提取工藝。

1.3.2 藤茶中總黃酮含量測定方法的建立與比較

（1）二氫楊梅素標準品溶液制備精密稱定適量二氫楊梅素標準品，用95%乙醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，配成0.499 6 mg·mL-1的標準品溶液，備用。

（2）樣品溶液制備稱取5 g藤茶，10倍量75%乙醇浸泡18 h，超聲1 h，過濾，取1 mL濾液于50 mL容量瓶中，95%乙醇定容，然后取5 mL于50 mL容量瓶中，95%乙醇稀釋至刻度線，備用。

（3）直接測定法精密吸取藤茶樣品溶液2.5 mL于25 mL容量瓶中，另取0.5 mL二氫楊梅素標準品溶液于另一個25 mL容量瓶中，并采用95%乙醇定容，搖勻后靜置10 min，在200～700 nm波長進行掃描，根據掃描光譜圖，確定該方法的最適吸收波長為294 nm。然后分別準確吸取0.250 mL、0.375 mL、0.500 mL、0.625 mL和0.750 mL二氫楊梅素標準品溶液于5個不同25 mL容量瓶，95%乙醇定容，搖勻，靜置10 min，在此方法最適吸收波長處測定吸光度，繪制標準曲線，測定藤茶樣品溶液的吸光度并計算其中藤茶總黃酮的含量。

（4）硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉[Al(NO3)3-NaNO2-NaOH）]比色法（簡稱硝酸鋁法）。精密吸取藤茶樣品溶液1.5 mL于25 mL容量瓶中，另取0.25 mL二氫楊梅素標準品溶液于另一個25 mL容量瓶中，加入5 mL蒸餾水，搖勻后加入1 mL 5% NaNO2溶液搖勻并靜置6 min，加入1 mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻靜置6 min，加入10 mL 10 mol·L-1NaOH溶液，加蒸餾水至刻度線后搖勻靜置15 min，在200～700 nm波長進行掃描，根據掃描光譜圖，確定該方法的最適吸收波長為324 nm。然后分別準確吸取0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL和0.35 mL二氫楊梅素標準品溶液于25 mL容量瓶，按上述方法進行處理，在此方法最適吸收波長處測定吸光度，繪制標準曲線，測定藤茶樣品溶液的吸光度并計算其中藤茶總黃酮的含量。

1.3.3 藤茶總黃酮水提物及其主要化合物抗氧化活性評價

（1）DPPH溶液的制備。精密稱取DPPH試劑適量，加乙醇溶解配制成0.65 mmol·L-1。

（2）樣品溶液的制備。精密稱取2.00 mg藤茶提取物，加入乙醇溶液，定容至10 mL，恒溫超聲提取30 min，冷卻至室溫，用50%乙醇逐級稀釋成系列濃度的樣品溶液。

（3）對照品溶液的制備。精密稱取蘆丁、抗壞血酸、二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素和橙皮素適量，加入二甲基亞砜適量配成20 mmol·L-1母液，用50%乙醇逐級稀釋成系列濃度的對照品溶液。

（4）抗氧化活性的測定。精密量取10 μL樣品提取液和對照品溶液，分別加入有100 μL DPPH溶液的96孔板中，充分混勻，加入140 μL的50%乙醇，室溫避光反應1 h，混勻，在517 nm下測定吸光度。以加入50%乙醇溶液為空白對照，各平行3份。并計算抑制率：

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A0為空白對照溶液的吸光度。

分別以各樣品溶液濃度和抑制率進行線形回歸，并計算抑制率為50%時，待測樣品的濃度值，即半抑制濃度IC50。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系考察

分別準確吸取0.250 mL、0.375 mL、0.500 mL、0.625 mL和0.750 mL二氫楊梅素標準品溶液于25 mL容量瓶，95%乙醇定容，搖勻，靜置10 min，在最適吸收波長處（294 nm）測定吸光度，以吸光度（Y）對各對照品濃度（X）進行線性回歸。

分別準確吸取0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL和0.35 mL二氫楊梅素標準品溶液于25 mL容量瓶，加入5 mL蒸餾水，搖勻后加入1 mL 5% NaNO2溶液搖勻并靜置6 min，加入1 mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻靜置6 min，加入10 mL 10 mol·L-1NaOH溶液，加蒸餾水至刻度線后搖勻靜置15 min，在最適吸收波長處測定吸光度（324 nm），以吸光度（Y）對各對照品濃度（X）進行線性回歸，評價兩種檢測方法的線性關系。

直接測定法和硝酸鋁法的線性關系見表1，以二氫楊梅素標準品溶液的系列濃度（μg·mL-1）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，分別得到兩種方法相應的線性回歸方程。直接測定法在線性范圍為4.996 ～ 14.988 μg·mL-1時，R2為 0.999 3，線性關系較好；硝酸鋁法在線性范圍為2.998～6.994 μg·mL-1時，R2為0.999 7，線性關系較好。

表1 兩種測定方法的線性關系表

2.1.2 精密度實驗

準確移取上述藤茶樣品溶液2.5 mL和1.5 mL，分別按照1.3.2項下2種方法進行處理，然后在各方法的最大吸收波長處（294 nm和324 nm），在2 min內對同一樣品溶液連續測定6次，計算測定吸光度的平均值和RSD值。直接測定法和硝酸鋁法測定藤茶樣品溶液總黃酮的精密度實驗中，RSD值分別為1.4%和1.8%，均小于3%，說明采用紫外分光光度計測定總黃酮精密度較好。

2.1.3 重復性實驗

分別按照1.3.2項下2種方法處理藤茶樣品溶液各5份，然后測定各藤茶樣品中總黃酮的含量，并計算其平均值和RSD值。結果表明，直接測定法和硝酸鋁法測定藤茶樣品溶液中總黃酮的含量分別為0.069 mg·mL-1和 0.083 1 mg·mL-1，RSD 值分別為 2.1%和2.4%，均小于5%，在誤差允許范圍內，說明采用上述兩種方法測定藤茶提取液中總黃酮的含量，均有較好的重復性。

2.1.4 穩定性實驗

準確移取藤茶樣品溶液2.5 mL和1.5 mL，分別按照1.3.2項下2種總黃酮含量測定方法進行處理，然后在 0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h和4.0 h時，在各方法最大吸收波長處測定一次吸光值，共測定9次，計算各方法測定吸光度的平均值和RSD值。穩定性實驗顯示，直接測定法在4 h內的穩定性最好，RSD值僅為1.3%，硝酸鋁法在4 h內的穩定性最差，RSD值為7.8%，而在1.0 h內的RSD值為2.1%，說明硝酸鋁法在1.0 h內基本穩定。由此可見，直接測定法建立的總黃酮測定方法穩定性更好。

2.1.5 加標回收率實驗

準確移取藤茶樣品溶液1.25 mL和0.75 mL各9份藤茶樣品溶液，按照80%、100%和120%比例分別加入一定量的二氫楊梅素標準品溶液后，分別按照1.3.2項下2種總黃酮含量測定方法進行處理，分別在上述方法中最大吸收波長處（294 nm和324 nm）測定藤茶樣品溶液的吸光值，并計算其加樣回收率和RSD值。結果表明，采用直接測定法測定藤茶總黃酮的含量平均加樣回收率為100.5%，RSD為4.2%（表2）；采用硝酸鋁顯色法測定藤茶總黃酮的含量平均加樣回收率為102.8%，RSD為6.2%（表3），兩種方法中硝酸鋁顯色法測定誤差較大。結合方法學考察結果，最終選擇直接測定法測定樣品中總黃酮的含量。

表2 直接測定法加標回收率實驗結果表

表3 硝酸鋁法加標回收率實驗結果表

2.2 藤茶總黃酮水提工藝研究

2.2.1 提取溶劑量的初步考察

取50 g藤茶，分別加入不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50）的水煎煮2 h，煎煮2次，合并水煎液，過濾，采用直接測定法測定藤茶水煎液中藤茶總黃酮的濃度，并計算總黃酮提取率。

由圖1可知，隨著提取液加入量的增加，藤茶總黃酮提取率先上升后逐漸下降，當料液比為1∶40時，總黃酮提取率達到最高。繼續增加提取液用量，總黃酮提取率不再升高，考慮到提取液增多，使得濃縮時間變長，降低了提取效率。綜合考慮經濟效益，提取料液比選擇1∶40最佳。

2.2.2 提取時間的初步考察

實驗考察不同提取時間（1 h、1.5 h、2 h和2.5 h）對藤茶總黃酮提取效率的影響。由圖2可知，隨著提取時間的增加，總黃酮提取率先升高后降低，當提取時間達到2 h時，總黃酮提取率最高。綜合考慮，初步確定提取時間為2 h。

2.2.3 提取次數的考察

實驗考察不同提取次數（1次、2次、3次）對藤茶總黃酮提取效率的影響。由圖3可知，隨著提取次數的增加，總黃酮提取率先升高后降低，提取次數為2次時，總黃酮提取率最高。綜合考慮，初步確定提取次數為2次。

2.2.4 水提工藝正交試驗及方差分析

采用L9(34)正交試驗表，考察料液比（1∶20、1∶30、1∶40）、提取時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h）和提取次數（1次、2次、3次）3個因素，以總黃酮提取率為考察指標，進行水提工藝條件的優選，確定最佳水提提取工藝。正交實驗結果見表4，方差分析見表5。

由表4可知，在不考慮交互作用的情況下，影響水提工藝的因素主次順序為料液比＞提取時間＞提取次數。由表5可知，料液比對總黃酮提取率有顯著性影響，而提取時間、提取次數在考察范圍內影響不顯著。因此，藤茶總黃酮提取的最佳工藝條件為A3B3C2，即選用料液比1∶40，提取2 h，提取2次。

表4 正交試驗結果表

表5 正交試驗方差分析表

2.2.5 最佳工藝驗證實驗

由表6可知，按照最佳提取溶液開展驗證實驗，3次實驗藤茶總黃酮提取率分別為62.61%、62.40%和61.66%，說明該工藝穩定可行。

表6 重復性試驗結果表

2.3 測定結果

由表7可知，藤茶水提物對DPPH自由基清除能力強弱與黃酮含量呈正相關性，表明藤茶提取物中黃酮類化合物的抗氧化活性占主導地位。藤茶總黃酮水提物IC50=0.176 mg·mL-1，總黃酮DPPH自由基清除能力略低于維生素C（IC50=0.147 mg·mL-1），高于蘆丁（IC50=0.192 mg·mL-1）。藤茶中主要的4種黃酮類單體化合物均有較強的清除作用，對DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加而增強。對DPPH自由基清除能力為楊梅素＞槲皮素＞二氫楊梅素＞維生素C＞橙皮素。

表7 藤茶總黃酮提取物和主要黃酮類單體化合物抗氧化活性結果表

3 結論

本文以二氫楊梅素為對照品，選用直接測定法和硝酸鋁法對藤茶中總黃酮含量進行測定，結果表明兩種測定方法相對應的最適吸收波長分別為294 nm和324 nm。在該波長下，直接測定法和硝酸鋁法測定藤茶總黃酮，在 4.996 ～ 14.988 μg·mL-1和 2.998 ～ 6.994 μg·mL-1線性關系良好；精密度、重復性良好；穩定性結果表明，直接測定法在4 h內的穩定性最好，硝酸鋁法在1.0 h內基本穩定，4 h內的穩定性較差。同時，加標回收率實驗結果表明采用硝酸鋁顯色法測定藤茶總黃酮的含量平均加樣回收率為102.8%，RSD為6.2%，兩種方法中硝酸鋁顯色法測定誤差較大，最終選擇直接測定法測定藤茶中總黃酮的含量。

藤茶總黃酮是藤茶中主要活性成分，采用水提法制備藤茶總黃酮，采用單因素和正交實驗得到的最佳提取工藝為料液比1∶40，提取2 h，提取2次。3次驗證性實驗表明，所制備藤茶水提物中總黃酮提取率分別為62.61%、62.40%和61.66%，說明該工藝穩定可行。運用DPPH法對藤茶水提物及其黃酮類單體成分的自由基清除能力進行評價，結果表明，藤茶水提物對DPPH自由基清除能力強弱與黃酮含量大小呈正相關性，對DPPH自由基清除能力略高于蘆丁。藤茶中主要的4種黃酮類單體化合物均有較強的清除作用，對DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加而增強，對DPPH自由基清除能力為楊梅素＞槲皮素＞二氫楊梅素＞維生素C＞橙皮素，其中楊梅素、二氫楊梅素和槲皮素可能是藤茶抗氧化的主要化學成分。

藤茶作為一種保健茶，在民間飲用歷史可上溯到神農嘗百草時期。我國最早的詩歌總集《詩經》稱之為古茶勾藤。它不僅是一種純天然的綠色飲料，更是一種藥效保健性能很強的茶中奇葩。藤茶素有“黃酮之王”的稱號，本文通過提取工藝優化，可以使藤茶總黃酮提取率達到60%以上，同時藤茶提取物可以迅速溶解到溶液中，服用后發揮抗氧化、抗炎的功效。藤茶提取物對DPPH自由基清除能力強弱與黃酮含量大小呈正相關性。目前已證實自由基氧化損傷與衰老及多種疾病相關，當體內自由基產生過多或/和清除過少時都會打破人體內自由基平衡，使多余的自由基攻擊人體內的生物膜，造成體內脂質、蛋白質、核酸、酶等生物大分子的氧化損傷，破壞細胞結構和功能完整，從而影響人體正常新陳代謝、產生疾病[13]。因此，藤茶作為一種營養價值較高的藥用原料，具有很高的開發利用價值。