發酵乳中三氯蔗糖檢測方法的改進

◎ 李加輝，崔瑞霞，賽 平，王 乾，翟于尊

（河南中測技術檢測服務有限公司，河南 鄭州 450000）

發酵乳是一種較為健康的食品。發酵乳中含有多種乳酸菌，符合現代人對健康飲食的需求，具有較大的發展前景。為了滿足消費者的口味，生產商在發酵乳生產過程中添加食品添加劑，對其進行不同程度的調配[1-3]。目前乳制食品中添加劑的監管項目主要包括微生物、維生素和質量指標等，發酵乳制食品中的三氯蔗糖檢測也存在檢測限值。

《食品安全國家標準 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》（GB 22255—2014）測定發酵乳中三氯蔗糖用的是甲醇去除蛋白質，再對提取溶劑進行縮分，目的是去除蛋白質對三氯蔗糖峰的干擾，整個操作過程用時較長，且很煩瑣，對檢測結果的準確性和重復性造成直接影響[1]。有研究采用亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液沉淀蛋白質，效果較好，但該方法對樣品進行了稀釋，降低了提取液中三氯蔗糖的含量，不利于三氯蔗糖含量較低的發酵乳的檢測[2-8]。國家標準使用液相色譜，用RID或ELSD檢測器進行食品中三氯蔗糖的測試。但在食品實驗室中，UV和DAD的普及度更高。本文以乙酸沉淀法進行前處理，采用HPIC-DAD進行食品中三氯蔗糖的檢測，通過對實驗條件的改變與優化，建立一種適用于批量檢測的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發酵乳，市售；標準品：三氯蔗糖（CAS號：56038-13-2；純度99.9%；Dr.E）；乙腈、甲醇、乙酸：色譜純，美國默克公司；0.22 μm有機濾膜、C18固相萃取柱，默克公司；蒸餾水。

1.2 儀器與設備

Waters 液相色譜儀，美國 Waters 公司；DAD 檢測器，美國 Waters 公司；XB- C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），美國Phenomenex公司；優普純水機，美國Millipore公司；電子天平，上海科創色譜科技有限公司；水浴鍋，超聲清洗儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：乙腈+水＝12+88（V/V）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣體積：20 μL；Waters2998 DAD 檢測器。

1.3.2 標準溶液的配制

稱取三氯蔗糖標準品10.001 2 mg，用流動相溶解，轉移至10.0 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻得到濃度為1.001 2 mg·mL-1的標準溶液。把標準溶液用流動相逐級稀釋成濃度為 0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1和0.80 mg·mL-1的系列標準溶液。

1.3.3 回收率標準溶液的配制

精密稱取三氯蔗糖標準品12.52 mg，20%乙腈溶解后轉移至25 mL容量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.500 8 mg·mL-1的回收率標準溶液。

1.3.4 樣品處理

精確稱取5.00 g左右樣品于50 mL離心管中，加入10 μL乙酸，渦旋搖勻后，超聲處理10 min后，10 000 r·min-1離心3 min，上清液全部轉移到C18固相萃取柱（依次用3 mL甲醇、3 mL水活化），用3 mL去離子水淋洗，棄去淋洗液，真空抽干C18柱，用甲醇洗脫，收集洗脫液于50 mL的蒸發皿內沸水浴蒸近干，加入1 mL乙腈水（體積比3∶22）溶解殘渣，過0.22 μm有機濾膜后上機測定。

1.3.5 測定

在1.3.1色譜條件下，待儀器基線穩定后，分別注入標準溶液和樣品溶液20 μL于液相色譜儀中，記錄峰面積，根據標準品的保留時間定性，外標法定量。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

為提高目標物的分離效果及提取效率，通過回收率實驗對比4種沉淀蛋白的方法對檢測結果的影響。在發酵乳酸性奶油和干酪中分別按照0.1 g·kg-1添加三氯蔗糖，進行回收實驗，結果見表1。結果表明，用0.2%乙酸沉淀蛋白，3種不同類別的發酵乳的回收率較穩定，均在86.7%～93.5%。此外，該方法在實驗過程中操作簡單，用時短，因此本實驗采用此方法作為發酵乳中三氯蔗糖測定的前處理方式。

表1 不同前處理方法測定三氯蔗糖的回收率表（單位：%）

2.2 色譜條件的確定

本實驗分別采用 2.4 μm、3.7 μm、4.6 μm 色譜填料的色譜柱進行分離，對比發現2.4 μm分離效果顯著且最好，同時分析時間最短。由于三氯蔗糖用二極管陣列檢測在190～800 nm下光譜吸收遞減，所以DAD檢測器只能以190 nm的最大吸收來檢測。當用大于15%乙腈進行分離時，三氯蔗糖很快出峰，不能較好分離，若調整為小于10%乙腈時，出峰時間太慢、峰較寬且響應比較低，當乙腈為12%，出峰較好，故DAD檢測器的流動相比例確定為乙腈∶水=3∶22（V/V）。

2.3 標準曲線與檢出限

取1.3.2下的系列標準工作液分別進樣20 μL，測定峰面積，用濃度和峰面積進行回歸分析。經測定和計算，在進樣濃度0.02～0.80 mg·mL-1，峰面積和濃度呈線性，回歸方程為y=133 630x-372，相關系數r為0.999 6。采用溶劑稀釋法，將三氯蔗糖標準溶液不斷稀釋，在色譜條件不變情況下進行測定，以3倍信噪比計算檢出限為4.6 mg·L-1。按樣品取樣量為2 g，定容體積為1 mL計算，檢出濃度下限為0.002 3 g·kg-1，比現行國標方法相關文獻檢測方法結果更低[14-15]。

2.4 方法的重復性

在空白發酵乳中加入三氯蔗糖標準溶液制得濃度為0.025 g·kg-1的模擬樣品，按上述方法處理，重復進樣6次，測定含量，計算相對標準偏差。經測定和計算，進樣6次的RSD為0.79%，說明方法的重復性較好，具體見表2。

表2 重復測定結果表

2.5 方法的準確性

以干酪為樣品基質，分別加入三氯蔗糖標準溶液制得 0.025 g·kg-1、0.050 g·kg-1、0.200 g·kg-1低中高3個水平的加標，按1.3.4方法處理，測定峰面積，并計算回收率，結果見表3。回收率均符合實驗室質量控制相關標準要求[9-13]。

表3 不同濃度下加標回收率表

3 結論

本研究優化了發酵乳中三氯蔗糖的測定方法，通過檢出限、重復性和準確性試驗表明可以利用乙酸沉淀蛋白法結合DAD檢測法達到現行標準要求。乙酸沉淀蛋白法結合DAD檢測法測定三氯蔗糖優勢是有機試劑使用量節約50%以上，同時操作簡單、省時省力。此外，對于食品檢測實驗室，液相色譜的檢測器擁有比例為DAD＞RID＞ELSD，本實驗結果顯示DAD檢測器在檢測三氯蔗糖時一樣可以達到很好的效果，在大批量檢測時，是一種比較值得推廣的方法。