發(fā)酵乳中三氯蔗糖檢測方法的改進(jìn)

◎ 李加輝，崔瑞霞，賽 平，王 乾，翟于尊

（河南中測技術(shù)檢測服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450000）

發(fā)酵乳是一種較為健康的食品。發(fā)酵乳中含有多種乳酸菌，符合現(xiàn)代人對(duì)健康飲食的需求，具有較大的發(fā)展前景。為了滿足消費(fèi)者的口味，生產(chǎn)商在發(fā)酵乳生產(chǎn)過程中添加食品添加劑，對(duì)其進(jìn)行不同程度的調(diào)配[1-3]。目前乳制食品中添加劑的監(jiān)管項(xiàng)目主要包括微生物、維生素和質(zhì)量指標(biāo)等，發(fā)酵乳制食品中的三氯蔗糖檢測也存在檢測限值。

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》（GB 22255—2014）測定發(fā)酵乳中三氯蔗糖用的是甲醇去除蛋白質(zhì)，再對(duì)提取溶劑進(jìn)行縮分，目的是去除蛋白質(zhì)對(duì)三氯蔗糖峰的干擾，整個(gè)操作過程用時(shí)較長，且很煩瑣，對(duì)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性造成直接影響[1]。有研究采用亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液沉淀蛋白質(zhì)，效果較好，但該方法對(duì)樣品進(jìn)行了稀釋，降低了提取液中三氯蔗糖的含量，不利于三氯蔗糖含量較低的發(fā)酵乳的檢測[2-8]。國家標(biāo)準(zhǔn)使用液相色譜，用RID或ELSD檢測器進(jìn)行食品中三氯蔗糖的測試。但在食品實(shí)驗(yàn)室中，UV和DAD的普及度更高。本文以乙酸沉淀法進(jìn)行前處理，采用HPIC-DAD進(jìn)行食品中三氯蔗糖的檢測，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的改變與優(yōu)化，建立一種適用于批量檢測的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳，市售；標(biāo)準(zhǔn)品：三氯蔗糖（CAS號(hào)：56038-13-2；純度99.9%；Dr.E）；乙腈、甲醇、乙酸：色譜純，美國默克公司；0.22 μm有機(jī)濾膜、C18固相萃取柱，默克公司；蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 液相色譜儀，美國 Waters 公司；DAD 檢測器，美國 Waters 公司；XB- C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），美國Phenomenex公司；優(yōu)普純水機(jī)，美國Millipore公司；電子天平，上海科創(chuàng)色譜科技有限公司；水浴鍋，超聲清洗儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：乙腈+水＝12+88（V/V）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；Waters2998 DAD 檢測器。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品10.001 2 mg，用流動(dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至10.0 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻得到濃度為1.001 2 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。把標(biāo)準(zhǔn)溶液用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成濃度為 0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1和0.80 mg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 回收率標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品12.52 mg，20%乙腈溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.500 8 mg·mL-1的回收率標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 樣品處理

精確稱取5.00 g左右樣品于50 mL離心管中，加入10 μL乙酸，渦旋搖勻后，超聲處理10 min后，10 000 r·min-1離心3 min，上清液全部轉(zhuǎn)移到C18固相萃取柱（依次用3 mL甲醇、3 mL水活化），用3 mL去離子水淋洗，棄去淋洗液，真空抽干C18柱，用甲醇洗脫，收集洗脫液于50 mL的蒸發(fā)皿內(nèi)沸水浴蒸近干，加入1 mL乙腈水（體積比3∶22）溶解殘?jiān)^0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)測定。

1.3.5 測定

在1.3.1色譜條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，分別注入標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液20 μL于液相色譜儀中，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

為提高目標(biāo)物的分離效果及提取效率，通過回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)比4種沉淀蛋白的方法對(duì)檢測結(jié)果的影響。在發(fā)酵乳酸性奶油和干酪中分別按照0.1 g·kg-1添加三氯蔗糖，進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，用0.2%乙酸沉淀蛋白，3種不同類別的發(fā)酵乳的回收率較穩(wěn)定，均在86.7%～93.5%。此外，該方法在實(shí)驗(yàn)過程中操作簡單，用時(shí)短，因此本實(shí)驗(yàn)采用此方法作為發(fā)酵乳中三氯蔗糖測定的前處理方式。

表1 不同前處理方法測定三氯蔗糖的回收率表（單位：%）

2.2 色譜條件的確定

本實(shí)驗(yàn)分別采用 2.4 μm、3.7 μm、4.6 μm 色譜填料的色譜柱進(jìn)行分離，對(duì)比發(fā)現(xiàn)2.4 μm分離效果顯著且最好，同時(shí)分析時(shí)間最短。由于三氯蔗糖用二極管陣列檢測在190～800 nm下光譜吸收遞減，所以DAD檢測器只能以190 nm的最大吸收來檢測。當(dāng)用大于15%乙腈進(jìn)行分離時(shí)，三氯蔗糖很快出峰，不能較好分離，若調(diào)整為小于10%乙腈時(shí)，出峰時(shí)間太慢、峰較寬且響應(yīng)比較低，當(dāng)乙腈為12%，出峰較好，故DAD檢測器的流動(dòng)相比例確定為乙腈∶水=3∶22（V/V）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

取1.3.2下的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，用濃度和峰面積進(jìn)行回歸分析。經(jīng)測定和計(jì)算，在進(jìn)樣濃度0.02～0.80 mg·mL-1，峰面積和濃度呈線性，回歸方程為y=133 630x-372，相關(guān)系數(shù)r為0.999 6。采用溶劑稀釋法，將三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液不斷稀釋，在色譜條件不變情況下進(jìn)行測定，以3倍信噪比計(jì)算檢出限為4.6 mg·L-1。按樣品取樣量為2 g，定容體積為1 mL計(jì)算，檢出濃度下限為0.002 3 g·kg-1，比現(xiàn)行國標(biāo)方法相關(guān)文獻(xiàn)檢測方法結(jié)果更低[14-15]。

2.4 方法的重復(fù)性

在空白發(fā)酵乳中加入三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制得濃度為0.025 g·kg-1的模擬樣品，按上述方法處理，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。經(jīng)測定和計(jì)算，進(jìn)樣6次的RSD為0.79%，說明方法的重復(fù)性較好，具體見表2。

表2 重復(fù)測定結(jié)果表

2.5 方法的準(zhǔn)確性

以干酪為樣品基質(zhì)，分別加入三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制得 0.025 g·kg-1、0.050 g·kg-1、0.200 g·kg-1低中高3個(gè)水平的加標(biāo)，按1.3.4方法處理，測定峰面積，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。回收率均符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求[9-13]。

表3 不同濃度下加標(biāo)回收率表

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了發(fā)酵乳中三氯蔗糖的測定方法，通過檢出限、重復(fù)性和準(zhǔn)確性試驗(yàn)表明可以利用乙酸沉淀蛋白法結(jié)合DAD檢測法達(dá)到現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)要求。乙酸沉淀蛋白法結(jié)合DAD檢測法測定三氯蔗糖優(yōu)勢(shì)是有機(jī)試劑使用量節(jié)約50%以上，同時(shí)操作簡單、省時(shí)省力。此外，對(duì)于食品檢測實(shí)驗(yàn)室，液相色譜的檢測器擁有比例為DAD＞RID＞ELSD，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DAD檢測器在檢測三氯蔗糖時(shí)一樣可以達(dá)到很好的效果，在大批量檢測時(shí)，是一種比較值得推廣的方法。