妊娠期糖尿病患者腸道菌群分布特點及與血脂、IL-6 的關系分析

楊聰美，胡淋淋，鄭小蔚，吳晶晶

福建醫科大學附屬第二醫院，福建泉州 362000

妊娠期糖尿病（GDM）是圍生期常見的并發癥，發病率為2.3%~4.3%[1]，隨著人們生活水平的提高及二胎政策的開放，GDM 的發病率逐年增加。 研究表明，GDM 不但在近期影響到產婦， 在遠期發展中可增加妊娠婦女及其子代并發癥發生， 且子代糖尿病的發生率亦明顯升高[2-3]。 腸道菌群作為微生態系統的重要組成部分，廣泛參與人體的營養、代謝、免疫調控及機體炎癥反應[4-5]。研究顯示，GDM 的發生、發展與腸道菌群失調直接相關。 基于此， 該研究選2021 年6—11 月收集80 例妊娠期糖尿病患者進行研究，同時與健康孕婦作為對照組，旨在獲得妊娠期糖尿病患者腸道菌群分布特點及與血脂、IL-6 的關系。 現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

診斷標準[6]：即對所有尚未被診斷為糖尿病的孕婦，在妊娠24~28 周及孕28 周后首次就診時行75 g OGTT，空腹、服糖后1 h 和2 h 血糖界值分別為5.1、10.0、8.5 mmol/L，其中任何一項血糖值達到或超過上述標準即診斷為GDM。 納入標準[7]：選取于福建醫科大學附屬第二醫院產科門診產前檢查， 妊娠24~28周的孕婦作為研究對象。依據2017 年ADA GDM 診斷標準，所有受試者入組前需簽署知情同意書。排除標準[8]：①樣本采集前30 d 內服用過抗生素或抗真菌藥物者。②采集樣品前2 周服用過益生菌產品者。③孕前及孕早期即被診斷為糖尿病者。 ④1 個月內曾服用過可能干擾糖、脂代謝藥物（如胰島素、格列本脲、消炎痛、酚妥拉明、速尿、苯妥英鈉、可的松等）者。⑤合并影響糖代謝或腸道微生態疾病（如甲狀腺功能異常、哮喘、高血壓、腹瀉、炎癥性腸病、腸應激綜合征、 胃腸道手術史等） 者。 ⑥抽煙飲酒者。 將GDM 孕婦設置為研究組， 健康孕婦設置為對照組，各 80 名。 研究組年齡 21.0~35.0 歲， 平均 （27.63±2.51）歲；孕周 24.0~28.0 周，平均（25.04±2.45）周。 對照組年齡 21.0~35.0 歲，平均（28.28±2.37）歲；孕周24.0~28.0 周，平均（25.13±2.51）周。 兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。 該研究經該院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 大便標本采集 將所有研究對象的糞便（≥2 g）均于排便后30 min 內收集在密閉的無菌離心管內，將上述標本迅速儲存于-80℃低溫冰箱。

1.2.2 血清標本采集 將所有研究對象的空腹靜脈血（≥2 mL）收集在非抗凝管內（普通紅色頭蓋生化管），2 h 內室溫下在 3 000 r/min，離心 10 min，取上層血清于凍存管中-80℃冰箱保存。

1.2.3 生化指標收集 收集總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）指標及白介素-6（IL-6）指標。

1.2.4 細菌基因組總DNA 提取 使用Sigma 細菌基因組DNA 試劑盒提取糞便細菌總DNA。

1.2.5 DNA 的純化①每500 微升DNA 加入0.5 gCsCl，混合后在室溫下放置3 h，離心20 min(8 000 r/min)。②收集上清液，加入無菌水和冰異丙醇，混合后放置15 min,離心 15 min，沉淀的 DNA 溶于 500 μl TE 緩沖液。③加入 100 μl 8M KOA 溶液，放置 15 min，離心 15 min，收集上清液，加入0.6 倍體積冰異丙醇，輕輕混合后置于冰上 10 min。 離心 10 min， 沉淀的 DNA 用70 %乙醇沖洗后，溶于500 μl 的TE 緩沖液。

1.2.6 細菌16S rRNA 基因擴增 使用細菌16S通用引物， 擴增糞便樣品的16S rRNA V4 保守區，PCR擴增每個樣品對應相應的barcode 上下游引物信息，擴增體系為25 μl 體系，采用Takara Ex Taq，細菌總DNA 模板為 2 μl。 擴增條件如下：94℃，2 min；94℃，30 s；59℃，30 s；72℃，30 s；25 個循環；72℃，5 min[9-10]。

1.2.7 細菌16S rDNA 基因測序 使用 Qubit 2.0 和0.8%瓊脂糖凝膠電泳對提取得到的DNA 進行質檢。使用MetaVxTM文庫構建試劑盒構建測序文庫。 使用Agilent2100 Bioanalyzer 對文庫進行質檢， 帶有不同barcode 的文庫通過定量和均一化， 混合后使用Illumina MiSeq 測序儀進行300PE 測序。

1.3 統計方法

采用qiime 2.0 對腸道菌群組成進行生物信息學分析，通過Bray-cuits, Weighted Unifac, Unweighted Unifrac 等方法分析菌群整體結構差異； 利用Wilcox 秩和檢驗、隨機森林（Random Forest）、LEfSe等方法，篩選出對分組效果貢獻最高的OTU 或物種列表； 再根據微生物群落豐度信息計算樣本中物種之間的相關性，并據此劃分不同的共變化組（CAG），使用Spearman 分析CAG 與生理指標的相關性；用隨機森林 （Random Forest） 的方法篩選出最重要的marker， 隨后用10 倍交叉驗證和ROC 選出最優的Biomarker 組合和設計出最優的分類器。 采用SPSS 20.0 統計學軟件進行臨床數據分析， 符合正態分布的計量資料用（）表示，比較采用 t 檢驗；3 組及以上均數比較采用One-wayANOVA。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腸道菌群菌落數比較

研究組腸球菌、腸桿菌、擬桿菌群菌落數高于對照組，乳桿菌、雙歧桿菌低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 兩組梭桿菌菌落數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 兩組腸道菌群菌落數比較[（），logN/g]

表1 兩組腸道菌群菌落數比較[（），logN/g]

組別研究組（n=80）照組（n=80）對t 值P 值腸球菌8.30±1.46 7.01±0.92 6.686＜0.001腸桿菌 乳桿菌 雙歧桿菌9.77±0.98 7.01±0.63 21.189＜0.001 5.39±0.68 7.73±1.43 13.218＜0.001 7.39±0.66 10.63±0.73 29.447＜0.001梭桿菌 擬桿菌3.47±0.59 3.51±0.72 0.384 0.701 9.47±1.65 7.86±1.42 6.546＜0.001

2.2 兩組血液指標比較

研究組IL-6 與血脂指標中TC、TG及LDL-C 高于對照組，而HDL-C 低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表 2。

表2 兩組血液指標比較[（），mmol/L]

表2 兩組血液指標比較[（），mmol/L]

組別研究組（n=80）對照組（n=80）t 值P 值TC 5.94±1.72 4.11±0.62 26.640＜0.001 TG HDL-C 2.30±0.66 1.04±0.08 16.951＜0.001 1.77±0.18 2.85±0.32 26.310＜0.001 LDL-C IL-6（mg/L）4.53±0.43 2.14±0.31 40.326＜0.001 148.37±19.67 77.63±12.52 27.136＜0.001

2.3 腸道菌群與血脂、IL-6 的相關性

分析結果顯示，腸球菌與TC、TG、LDL-C 及IL-6 呈正相關 （P＜0.05）； 腸桿菌與 TC、TG、LDL-C 及IL-6 呈正相關（P＜0.05）；乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌與 TC、TG、LDL-C 及 IL-6 呈負相關（P＜0.05）。 見表3。

表3 腸道菌群與血脂、IL-6 的相關性分析

3 討論

妊娠期糖尿病是孕期最常見的并發癥之一，近年發病率逐漸升高，嚴重影響母嬰健康。 研究顯示，孕期女性腸道菌群組成和數量隨孕周的延長逐漸改變患者腸道菌群水平，可能與炎癥反應有關。機體腸道除能吸收人體飲食外， 還能直接吸收小分子的葡萄糖或單糖，研究指出，腸道菌群通過刺激腸道產生某些特定細胞因子，影響胰島素的敏感性[11-13]。 當多種因素引發益生菌數量下降，致病菌數量增加時，腸道內微生態環境破壞導致菌群失調， 循環系統中內毒素水平上升，產生慢性炎癥及糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病。腸道微生物可以將食物中的碳水化合物降解成單糖，還可以通過發酵膳食纖維而產生短鏈脂肪酸（SCFAs），其參與膽汁酸的合成、代謝和重吸收，進而對脂類的消化和吸收產生了間接的影響[14-15]。研究發現， 腸道菌群中些條件致病菌產生的脂多糖（LPS）進入血液，上調脂肪組織中促炎性細胞因子和趨化因子的表達，進而參與炎癥反應[16]。 在相關研究中指出，腸球菌和腸桿菌是最常見的腸道致病菌，威脅消化系統正常生理功能； 乳桿菌和雙歧桿菌為腸道益生菌，可抑制腸道內致病菌增殖，降低腸道pH，調節微生態環境； 梭桿菌和擬桿菌與腸道黏膜正常生理結構和功能密切相關， 且結構改變與糖尿病等代謝性疾病明顯相關。 該研究中，研究組腸球菌、腸桿菌、擬桿菌群菌落數高于對照組，而乳桿菌、雙歧桿菌低于對照組（P＜0.05）。 考慮到腸道乳酸桿菌不僅能夠幫助腸道對食物進行消化吸收， 且能夠調節血脂，分解有毒物質。 推測在GDM 患者中由于雙歧桿菌和乳酸桿菌總數的降低導致炎癥因子表達的升高，導致患者加劇GDM 的發生或發展，形成惡性循環。 GDM 患者腸道乳酸桿菌減少，腸道天然屏障減弱[17]。 分析結果顯示，腸球菌與 TC、TG、LDL-C 及IL-6 呈正相關（P＜0.05）；乳桿菌、雙歧桿菌和擬桿菌與 TC、TG、LDL-C 及 IL-6 呈負相關（P＜0.05）。 在糖尿病中，胰島素抵抗是妊娠期糖尿病的病理基礎，炎癥因子水平增加是胰島素抵抗的直接結果之一。 妊娠期糖尿病患者代謝產物增加， 改變腸道的厭氧環境和pH 水平，而益生菌多屬于專性厭氧菌，雙歧桿菌和乳酸桿菌總數對腸道內環境改變的敏感性最強，能夠調節炎癥因子，降低胰島素的抵抗，降低血糖。Hamid Akash M S 等[18]研究中指出，選取妊娠期糖尿病者110 例及健康體檢女性為對照組。 妊娠期糖尿病者腸球菌、腸桿菌、擬桿菌的菌落數明顯高于對照組， 妊娠期糖尿病組 IL-6 水平 （148.84±15.37）mg/L明顯高于正常對照（76.72±11.14）mg/L（P＜0.05）。

綜上所述， 在妊娠期糖尿病患者中腸道菌群腸球菌、腸桿菌、擬桿菌群菌落數較多，且腸球菌、腸桿菌與血脂、IL-6 水平呈正相關。