超濾離心法對(duì)CVB-D 脂質(zhì)體分離及包封率測(cè)定的效果分析

陳俊杰

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部制劑科 廣東 廣州 510000）

CVB-D 是從黃楊科植物小葉黃楊及同屬植物經(jīng)酸性醇提、堿化、萃取、重結(jié)晶所得的甾體生物堿，也稱(chēng)環(huán)維黃楊星D 環(huán)常綠黃楊堿D、黃楊寧、黃楊堿等，有抗心律失常、抗心肌缺血、舒張血管、降血壓等生理活性，臨床用于治療冠心病、心絞痛、心律失常、心肌缺血等疾病。其分子式為CHN，是一種白色針狀結(jié)晶，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。中國(guó)藥典（2000 版）采用非水滴定法測(cè)定CVB-D 含量，但此方法測(cè)定樣品中總生物堿含量，缺乏專(zhuān)屬性。

圖1 CVB-D 結(jié)構(gòu)式

脂質(zhì)體是一種人工合成膜。磷脂分子親水頭端插入水中，親水尾端伸向空氣，混合攪拌后形成類(lèi)脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的球狀脂質(zhì)體。脂質(zhì)體具有類(lèi)似細(xì)胞膜的特點(diǎn)，可使藥物遞送到細(xì)胞內(nèi)部。脂質(zhì)體具有可包封難溶性藥物、毒性小、生物相容性高等特點(diǎn)發(fā)展迅速。脂質(zhì)體的質(zhì)量評(píng)價(jià)包括形態(tài)、粒徑、包封率、載藥量和穩(wěn)定性等，而包封率是篩選脂質(zhì)體制備工藝和評(píng)價(jià)其質(zhì)量的重要指標(biāo)，對(duì)提高藥物治療作用、減輕藥物不良反應(yīng)以及降低藥物劑量作用極大。在《中國(guó)藥典（2010 版）》中，脂質(zhì)體制劑指導(dǎo)原則中規(guī)定脂質(zhì)體包封率不得小于80%。包封率的檢測(cè)需分別測(cè)定脂質(zhì)體藥物總含量和脂質(zhì)體外的游離藥物含量，然后再通過(guò)公式得出包封率，而分離脂質(zhì)體與游離藥物的方法通常有采用柱層析法、超濾離心法、透析法、魚(yú)精蛋白沉淀法、熒光法等。

本研究旨在采用超濾離心法從脂質(zhì)體中分離出游離CVB-D 后，利用UPLC-MS/MS 測(cè)定CVB-D 含量，從而計(jì)算脂質(zhì)體包封率。由于超濾離心法的離心速度和時(shí)間對(duì)超濾離心管洗脫能力影響較大，所以本實(shí)驗(yàn)先建立UPLCMS/MS 測(cè)定CVB-D 方法，再對(duì)離心速度和時(shí)間進(jìn)行考察以確定超濾離心法的離心條件。

1.儀器與材料

1260-6460 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司），TLE204/02 萬(wàn)分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器〈上海〉有限公司），超濾離心管（0.5 mL 10 KD，美國(guó)密理博公司），5 427 R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 股份公司），微孔濾膜（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），CVB-D 對(duì)照品（批號(hào)161217，成都瑞芬思生物科技有限公司），甲醇（色譜純，德國(guó)Merk 公司），乙腈（色譜純，德國(guó)Merk 公司）甲酸銨（質(zhì)譜純，德國(guó)CNW 科技公司），其他試劑（分析純，市售），水為自制超純水。

2.方法與結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS 測(cè)定CVB-D 方法的建立

2.1.1 對(duì)照品制備 CVB-D 對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取CVB-D 對(duì)照品10.0 mg 置于100 mL 量瓶甲醇定容，即得到0.100 mg/mL 的CVB-D 對(duì)照品溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Waters Xterra MS C18（2.1×50 mm 3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 含0.01 mol/L 甲酸銨的0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫程序（見(jiàn)表1）；流速：0.35 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL，檢測(cè)離子對(duì)為m/z403.4 →372.1。

表1 梯度洗脫程序

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取CVB-D 對(duì)照品溶液以甲醇定容配制成1 μL/mL、2 μL/mL、8 μL/mL、10 μL/mL、20 μL/mL、50 μL/mL，在上述建立的色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)與樣品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸（= 6），說(shuō)明樣品濃度在100 ～5 000 ng/mL 之間呈良好線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 UPLC-MS 測(cè)定CVB-D 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.4 專(zhuān)屬性檢驗(yàn) 分別取CVB-D 對(duì)照品溶液、空白脂質(zhì)體各100 μL 混勻后以甲醇稀釋至10 mL，再取CVB-D 對(duì)照品溶液100 μL 稀釋至10 mL，分別在上述建立的色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。CVB-D 特征峰的保留時(shí)間約3.8 min，無(wú)干擾且峰形良好，說(shuō)明本方法具有較好的專(zhuān)屬性，見(jiàn)圖3。

圖3 CVB-D 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

2.1.5 精密度考察 精密吸取對(duì)照品溶液1 000 μL置于10 mL 量瓶，甲醇定容，在2.1.2 下色譜質(zhì)譜條件下連續(xù)進(jìn)行5 次檢測(cè)，記錄CVB-D 的峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2。說(shuō)明儀器精密度符合要求。

表2 UPLC-MS 測(cè)定CVB-D 精密度考察

2.1.6 穩(wěn)定性考察 使用移液槍吸取對(duì)照品溶液100 μL 置于10 mL 量瓶，甲醇定容，在10 mL 色譜質(zhì)譜條件下，以首次測(cè)定時(shí)間點(diǎn)為0 h，在首次測(cè)定后的3 h，6 h，12 h，24 h 后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，記錄CVB-D 的峰面積。結(jié)果表明，CVB-D 在此方法下24 h 內(nèi)含量基本不變。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取20 μL，100 μL，200 μL 對(duì)照品溶液置于10 mL 量瓶，甲醇定容，每個(gè)樣品平行操作3 份。按照上述建立的色譜質(zhì)譜條件，測(cè)定CVB-D 的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3，發(fā)現(xiàn)UPLC-MS 測(cè)定CVB-D的加樣回收率符合樣品的分析要求。

表3 UPLC-MS 測(cè)定CVB-D 加樣回收試驗(yàn)

2.2 超濾離心法測(cè)定脂質(zhì)體包封率方法的建立

2.2.1 CVB-D 脂質(zhì)體的制備

精密稱(chēng)量CVB-D 10 mg，大豆卵磷脂100 mg，膽固醇20 mg，維生素E 10 mg，十八胺10 mg，以5 mL 無(wú)水乙醇超聲溶解，減壓旋蒸30 min，加入純化水繼續(xù)旋蒸水化1 h，探頭超聲3 s 停3 s 3 min 后，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.2破乳劑的選擇 分別取0.1 mL CVB-D脂質(zhì)體，分別加入1 mL 甲醇，無(wú)水乙醇，乙腈，10%曲拉通，5%SDS，再超聲5 min，觀察后，加入無(wú)水乙醇，10%曲拉通，5%SDS 的樣品出現(xiàn)渾濁，表明破乳不完全，并將澄清的甲醇、乙腈破乳脂質(zhì)體樣品過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，按2.1.2 項(xiàng)下質(zhì)譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被甲醇破乳后的樣品質(zhì)譜峰面積最高。故本實(shí)驗(yàn)選取甲醇作為破乳劑。

2.2.3 超濾離心轉(zhuǎn)速的考察 取0.5 mL CVB-D脂質(zhì)體加入超濾離心管中，分別以2 500 r/min、3 000 r/min、3 500 r/min、4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心30 min。濾液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，按2.1.2 項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4，發(fā)現(xiàn)離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min 時(shí)，峰面積最大，因此選擇4 000 r/min 進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

表4 超濾離心轉(zhuǎn)速的考察

2.2.4 超濾離心時(shí)間的考察 取0.5 mL CVB-D 脂質(zhì)體置于超濾離心管中，在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min 分別離心20、30、40 min。濾液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，按2.1.2 項(xiàng)下質(zhì)譜條件測(cè)定峰面積。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)離心時(shí)間為40 min 時(shí)，峰面積最大，但濾液出現(xiàn)渾濁，表明因離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而使脂質(zhì)體破裂。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取30 min 作為離心時(shí)間。

2.2.5 超濾加樣回收率 取1 mL 1 mg/mL CVB-D 溶液置于10 mL 量瓶以甲醇定容，取溶液0.5 mL、2 mL、4 mL以空白脂質(zhì)體溶液定容至10 mL，取0.5 mL 于超濾管中以4 000 r/min 離心30 min。取1 mL 濾液在2.1.2 項(xiàng)下質(zhì)譜條件測(cè)定CVB-D 含量，計(jì)算包封率，結(jié)果見(jiàn)表5，結(jié)果顯示，此方法測(cè)定CVB-D 脂質(zhì)體符合定量分析要求。

表5 CVB-D 加樣回收率

2.3 結(jié)果

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知采用流動(dòng)相為乙腈-含0.1%甲酸的0.01 mol/L 甲酸銨溶液進(jìn)行梯度洗脫程序測(cè)定CVB-D 的含量，在樣品濃度為100 ～5 000 ng/mL 呈良好線性關(guān)系，符合其他方法選考察指標(biāo)。超濾離心法條件為轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心時(shí)間30 min。包封率的測(cè)定方法為：取0.5 mL 樣品脂質(zhì)體加入超濾離心管，以4 000 r/min 離心30 min，取濾液以甲醇稀釋10 倍，以UPLC-MS 測(cè)定游離藥物濃度C 游。另取0.1 mL 樣品加甲醇定容至10 mL超聲5 min破乳，以UPLC-MS測(cè)定濃度C總，以下列公式計(jì)算包封率：

3.討論

由于CVB-D結(jié)構(gòu)中不含可被紫外檢測(cè)器檢測(cè)的雙鍵，《中國(guó)藥典（2015 版）》中采用的酸性染料比色法通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定，也有文獻(xiàn)報(bào)道采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）檢測(cè)CVB-D 的含量。其中，酸性染料比色法的專(zhuān)屬性較低，而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)儀器要求特殊。若使用HPLC-UV 法測(cè)定含量，通常使用柱前衍生化法使CVB-D 發(fā)生反應(yīng)，從而衍生出雙鍵可被紫外檢測(cè)器檢測(cè)，但衍生化試劑毒性大，衍生化容易使樣品中其他成分反應(yīng)影響CVB-D 檢測(cè)結(jié)果。超濾離心法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)短，但是耗材成本高，使用中也要注意大分子物質(zhì)在離心力的作用下在濾膜表面聚集，形成濃差極化層，小分子物質(zhì)難以透過(guò)，使濾膜的滲流量下降，分離效率降低。故需在測(cè)定前確定離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間。

綜上所述，超濾離心法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可以達(dá)到將脂質(zhì)體與游離藥物很好的分離的目的，用作CVB-D脂質(zhì)體的分離并測(cè)定包封率。