6S-5-甲基四氫葉酸鈣的食用安全性評價

馬文斌，薛 娟，涂 華，劉 康，成永之，連增林（通信作者）

（1 北京金康和信藥業科技有限公司 北京 100176）

（2 連云港金康和信藥業有限公司 江蘇 連云港 222000）

葉酸是一種必需的水溶性B 族維生素，自然存在于食物當中，尤其是水果、綠葉蔬菜和肝臟。由于葉酸最早是從植物葉子中提取出來的，是機體內重要的一碳單位共體，可以直接介入人體當中諸多主要的生長過程，如細胞分裂、細胞增殖、胚胎生長及蛋白的合成與代謝。葉酸已經成為一種具備醫療、保健和預防疾病等多功能藥物。經研究表明，葉酸能夠抑制腫瘤生長、作為產前維生素降低新生兒神經管畸形病變的發生、治療巨幼紅細胞貧血癥、影響骨髓中紅細胞分裂增殖速度。服用葉酸后能降低人體血清中同型半胱氨酸的水平，減輕內皮細胞損傷，降低腦卒中等心腦血管疾病的發生率。對保護機體健康有著重要意義。6S-5 甲基四氫葉酸是葉酸的主要活性成分，本文旨在探討食品原料6S-5-甲基四氫葉酸鈣的食用安全性，現報道如下。

1.資料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 SD 大鼠，SPF 級，體重180 ～213 g，生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016。昆明小鼠，SPF 級，體重19 ～22 g，生產許可證號：SCXK（滬）2013-0006，購買于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。標準顆粒飼料飼養，自由飲水。自然晝夜光線照明，相對濕度40%～70%，室溫20 ～25 ℃。實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2013-0008。動物飼料購買于蘇州雙獅實驗動物飼料科技服務有限公司，登記證號：蘇飼審（2009）05032。

1.1.2 受試物 6S-5-甲基四氫葉酸鈣（6S-5-MTHF Ca，葉源酸），白色至微黃色粉末，由連云港金康和信藥液有限公司提供。

1.1.3 測試菌株 試驗菌株TA97、TA98、TA100、TA102購買于美國分子毒理有限公司（MOLECULARTOXICOLOGY，INC.），產品質量保證書批號分別為：458D、4599D、4600D、4604D,通過其生物學特性方面鑒定，試驗菌株符合此次實驗的要求。

1.1.4 儀器設備 電子秤：ACS-3A 90401582；電子天平：BP310S 9100690；隔水式恒溫培養箱：GNP-9270 型104307；電子天平：Sartorius CP124S 13806202；全自動生化儀：7600-010（日本日立）766-7009；血液分析儀：XT-2000i 希森美康66541；臺式離心機：Mikro 22（HETTICH 公司）1105；電子天平：Bp3 100 s（沙多里斯公司）91006823；電子秤：ACS-3 型（上海泰和衡器廠）90401570；切片機：HM340E（德國蔡司公司）15782；脫水機：HMP110，（德國蔡司公司）15784；包埋機：AP280（德國蔡司公司）15787；染色機：HMS70（德國蔡司公司）15788。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性實驗 選擇體重符合實驗要求的SD大鼠、昆明小鼠，雌、雄，雌、雄各10 只，將雌、雄SD 大鼠、昆明小鼠分別放入鼠籠內，實驗前，雌、雄大鼠不禁水，禁食16 h 以后，實驗方法根據最大耐受量試驗原則指導，雌、雄大鼠稱重，灌胃容量按20 mL/kg BW計，相應劑量的供試液通過經口灌胃方式給予各組實驗動物，灌胃給藥每次間隔4 h，24 h 內分3 次灌胃，動物染毒后，每周對動物稱重1 次。觀察動物體重變化、精神狀態、反應性、毛發色澤、飲食、排泄狀況、中毒表現和死亡只數等，觀察周期為1 周。實驗全過程中如遇死亡動物或到期處死的動物，及時進行實體解剖，通過肉眼觀察，將有病理改變的動物組織器官情況均做詳細記錄。

1.2.2 骨髓細胞微核試驗 選擇體重合適的雌、雄性昆明小鼠，按體重隨機分為5 組，每組10 只，雌雄參半。供試液設定：1.25 g/kg、2.5 g/kg 和5.0 g/kg 組，另設陽性對照組（環磷酰胺40 mg）和溶劑對照組，雌、雄昆明小鼠逐只稱重，灌胃容量按0.4 mL/20 g·bw 計，相應劑量的樣本通過經口灌胃方式給予各組實驗動物，灌胃給藥采用30 h 2 次灌胃法，分別對各組動物灌胃。末次灌胃給藥后6 h，采用頸椎脫臼處死動物，對股骨骨髓進行取材，然后，加入小牛血清沖洗混勻，沖洗物移至載玻片上，均勻推片，干燥、干燥后放入甲醇中固定5 ～10 min，取出，晾干，涂片用Giemsa 染色20 min，蒸餾水沖洗后待檢。顯微鏡油鏡觀察下，逐只先進行計數1 000 個嗜多染紅細胞（PCE）的微核數，微核率通常以千分率表示，再計數嗜多染紅細胞（計數200 個PCE）時同時計數成熟紅細胞（NCE）數，并計算PCE/NCE值。

1.2.3 小鼠精子畸形實驗 選擇體重合適的雄性昆明小鼠，按體重隨機分為5 組，每組5 只。供試液設定：1.25 g/kg、2.5 g/kg 和5.0 g/kg 組，另設陽性對照組（環磷酰胺40 mg）和溶劑對照組，雌、雄昆明小鼠逐只稱重，灌胃容量按0.4 mL/20 g·bw 計，相應劑量的樣本通過經口灌胃方式給予各組實驗動物，連續5 d，每日灌胃給藥1 次。第1 次灌胃給藥后，第35 天采用頸椎脫臼處死動物，將兩側附睪取材后，放入0.9%氯化鈉溶液中，沖洗，剪碎，四層紗布過濾，取濾液至載玻片上涂片，甲醇固定5 min，2%伊紅水溶液染色制片，室溫干燥。高倍鏡下觀察，逐鼠計數1 000 個精子的畸形數，并詳細記錄畸形類型。

1.2.4 Ames 試驗 從液氮罐中取出一株菌株制作成主平板，準備15 mL/瓶營養肉湯，將分離好的單菌落懸浮其中。實驗菌液濃度控制在1.1 ～1.6×10/mL，溫度控制37 ℃ 120 次/分振蕩暗培養12 h。本次試驗按GB15193.4-2003 中鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗中平板摻入法進行，依次向保溫的45 ℃ 2 mL 頂層培養基中加入0.1 mLl 受試物和0.1 mL 菌株增菌液，需活化時，向板中加入0.5 mL S9 混合液，并且充分混勻迅速顛倒底層平板，實驗需要做3 個平行平板。37 ℃培養48 h，計數每皿中的回變菌落數，試驗重復1 次。

1.3 統計學方法

2.結果

2.1 大鼠急性毒性試驗

試驗期間大鼠未見明顯不良反應，觀察剖檢主要臟器未見肉眼可見病變。最大耐受劑量＞15 g/kg，屬無毒級，見表1。

表1 大鼠急性經口毒性試驗結果

2.2 小鼠急性毒性試驗

試驗期間各組未見任何不良反應和死亡動物，所有小鼠均表現正常飲食飲水，毛色光澤良好；實驗結束，處死動物，通過肉眼觀察每只動物的臟器組織，未見異常。樣品經口灌胃給藥的雌、雄小鼠，在急性經口毒性試驗中，最大耐受劑量MTD 均＞15 g/kg，屬無毒級，見表2。

表2 小鼠急性經口毒性試驗結果

2.3 骨髓細胞微核試驗

受試物各組劑量組PCE/NCE 比值、微核率與陰性對照組相比，差異無統計學意義（＞0.05），且受試物組PCE 占RBC 總數的比例不少于對照組的20%，提示受試物對小鼠骨髓細胞無抑制作用。經統計學分析，6S-5-甲基四氫葉酸鈣（L-5-MTHF Ca）骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果為陰性，見表3。

表3 動物骨髓嗜多染紅細胞微核發生率

2.4 小鼠精子畸形試驗

與溶劑對照組相比較，受試物各劑量組精子畸形率比較，差異無統計學意義（＞0.05），該受試物無致小鼠畸形作用，見表4。

表4 動物精子畸形發生率

2.5 Ames 試驗（致突變試驗）

在本次實驗條件下的2 次試驗中，在加和不加用S9活化系統平板摻入法檢測的條件下，各劑量組的回復菌落數均低于溶劑對照組的2 倍，故認為：該受試物的Ames 試驗檢測結果為陰性，見表5。

表5 第1 次試驗測試結果

3.討論

葉酸在人體內無法自身合成，需要通過外界補充獲取，一般在機體內處于結合狀態，且血漿中含量很低。只有單次口服劑量達到250 μg 時，血漿中才會出現游離的葉酸，6S-5 甲基四氫葉酸是葉酸的主要活性成分，其可以透過血腦屏障，預防老年癡呆、細胞貧血等癥狀。隨著研究深入，葉酸還有許多其他的治療用途，盡管這些用途不如前面提到的那么有效。葉酸可以預防潰瘍性結腸炎的腫瘤形成，防止宮頸發育不良，治療白癜風，恢復因葉酸缺乏而引起的大細胞貧血的造血功能，增加牙齦對局部刺激物的抵抗力，從而減少炎癥反應。為了造福人類，提高生活質量，我們以《食品安全性毒理學評價程序和方法》GB15193-2003 有關規定作為根據，對6S-5 甲基四氫葉酸鈣進行了安全性毒理學評價，以此證明該產品作為保健食品開發的可行性安全性依據。

本文結果顯示，樣品對雌雄大、小鼠的經口的最大耐受劑量MTD 均＞15 g/kg，屬于無毒級。遺傳毒性實驗中，Ames 試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、試驗結果均為陰性；生殖毒性試驗中，小鼠精子畸形試驗結果為陰性，表明6S-5 甲基四氫葉酸鈣對體細胞無致突變性。因此可以初步認為在本次試驗的條件下6S-5 甲基四氫葉酸鈣作為藥品和食品使用是安全可靠的。