IL-33增強(qiáng)胃癌細(xì)胞順鉑抵抗的機(jī)制研究

謝先澤 樊俏玫 黃偉 翁婭韻 姚文棟 陳云云 施政

據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌是男性第四大、女性第七大最常見的癌癥，全球每年有超過100萬的新病例。化療可在一定程度上緩解患者病情，延長生存期，但由于耐藥性和腫瘤轉(zhuǎn)移，胃癌患者預(yù)后較差[1]，接受手術(shù)治療的Ⅲ期胃癌患者5年生存率僅為18%～50%[2]。目前胃癌化療仍然以傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物為主，但常由于藥物無法有效控制腫瘤轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致患者死亡[3-4]。順鉑是胃癌，尤其是晚期胃癌的主要化療藥物，但由于長期使用，患者可出現(xiàn)耐藥性，順鉑對(duì)腫瘤的抑制能力逐漸減弱，最終導(dǎo)致化療失敗[5]。隨著對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制的深入探索，靶向治療已經(jīng)成為胃癌有效的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)：自噬在胃癌的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。在缺氧或營養(yǎng)的條件下，腫瘤細(xì)胞通過自噬降解衰老的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)來維持線粒體功能和能量平衡[6]。Zhuang等[7]發(fā)現(xiàn)：胃泌素17作用下胃癌細(xì)胞自噬增強(qiáng)，細(xì)胞增殖加快，其機(jī)制為胃泌素17誘導(dǎo)了自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1高表達(dá)。Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)：miR-181a通過靶向自噬相關(guān)基因ATG5提高胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，減少裸鼠異種移植胃癌組織的體積。可見，探索自噬相關(guān)機(jī)制已成為胃癌治療的新方向。本研究通過分析IL-33對(duì)胃癌細(xì)胞的作用，闡明其功能和被調(diào)控的機(jī)制，為胃癌的早期診斷和判斷預(yù)后提供新的候選靶標(biāo)，為未來基于IL-33/生長刺激表達(dá)基因2蛋白（growth STimulation expressed gene 2,ST2）的基因治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及來源 胃癌細(xì)胞MKN45細(xì)胞系（Cellbank-436）和胃癌旁正常胃上皮細(xì)胞GES-1（Cellbank-035）均購自浙江如耀生物科技有限公司。所有細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基（批號(hào)：L210KJ，上海源培生物公司）和10%FBS（批號(hào)：FBS500，上海源培生物公司）中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2，正常傳代。

1.2 主要材料 四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：C0009S）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：P0012S）、超敏電化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence,ECL）試劑盒（批號(hào)：P0018S）均購自上海碧云天生物科技有限公司；依托泊苷（批號(hào)：E809313-25 mg）、5-氟尿嘧啶（批號(hào)：F809394-1 g）、阿霉素（批號(hào)：A864033-25 mg）及順鉑（批號(hào)：D807330-250 mg）均購自上海麥克林試劑有限公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA，批號(hào)：M129496-1 g）購自上海阿拉丁試劑有限公司；兔抗Beclin1抗體（批號(hào)：R1509-1）、兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3α/β（LC3A/B）抗體（批號(hào)：ab128025）、ST2抗體（批號(hào)：ab25877）、兔抗β-微管蛋白（β-tubulin）抗體（批號(hào)：ab18207）和羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗（批號(hào)：ab6721）均購自英國Abcam公司；ST2抑制劑iST2-1（批號(hào)：DC12393）購自上海東蒼生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 IL-33對(duì)MKN45和GES-1細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法。在96孔板中接種MKN45和GES-1細(xì)胞，分別添加0、8、16、32、64、128和256 ng/L的IL-33，正常培養(yǎng)48 h；各樣品加入0.5 g/L的MTT溶液，孵育4 h；加入100 μl二甲基亞砜溶解沉淀的甲臜，搖動(dòng)15 min；測(cè)定每孔中細(xì)胞在波長570 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3.2 IL-33作用下胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的檢測(cè) 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞，依次加入0、20、40、60和80 ng/L 的IL-33；分別添加10 μmol/L的依托泊苷（依托泊苷組）、5-氟尿嘧啶（5-氟尿嘧啶組）、阿霉素（阿霉素組）及順鉑（順鉑組），共培養(yǎng)48 h。計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3.3 IL-33作用下胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑及其抑制劑敏感性的檢測(cè) 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞，依次加入 0、20、40、60和 80 ng/L 的 IL-33；設(shè)置順鉑組（樣品中添加10 μmol/L順鉑）和自噬抑制劑組（樣品中添加10 μmol/L順鉑，同時(shí)添加10 mmol/L的3-MA），共培養(yǎng)48 h。計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3.4 IL-33對(duì)胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot法。取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞，給予0、20、40和80 ng/L IL-33處理，提取細(xì)胞總蛋白并檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3A/B。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離包含等量蛋白質(zhì)的樣品，電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，并在4℃下用一抗孵育過夜。洗膜緩沖液洗滌后，加入二抗，室溫下孵育1 h。檢測(cè)到的蛋白帶通過增強(qiáng)的ECL化學(xué)發(fā)光液曝光，并使用Image J軟件進(jìn)行評(píng)估，量化后的數(shù)值以β-tubulin為內(nèi)參，計(jì)算Beclin1和LC3A/B相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 IL-33對(duì)胃癌細(xì)胞ST2表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞，給予10 μmol/L順鉑處理后，分成3組：即順鉑組，順鉑+IL33組（添加終質(zhì)量為60 ng/L的IL-33）和順鉑+IL-33+iST-2組（添加終質(zhì)量濃度為60 ng/L的IL-33和10 μmol/L的 iST2-1），以不添加任何試劑的胃癌細(xì)胞為空白對(duì)照組；分別在培養(yǎng)的第12、24、36和48 h收集細(xì)胞。采用MTT法檢測(cè)并計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。采用Western blot法檢測(cè)Beclin1、LC3A/B和ST2的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0繪圖和統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度IL-33對(duì)MKN45和GES-1細(xì)胞增殖影響的比較 不同質(zhì)量濃度IL-33對(duì)GES-1細(xì)胞增殖影響不大；0、8、16、32、64 ng/L IL-33處理下，MKN45細(xì)胞增殖無大變化，IL-33質(zhì)量濃度＞64 ng/L時(shí)，MKN45細(xì)胞增殖率上升，128 ng/L IL-33時(shí)增殖率為96.81%，256 ng/L IL-33時(shí)增值率為97.99%，與不添加IL-33相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同劑量IL-33對(duì)GES-1和MKN45細(xì)胞增殖影響的比較

2.2 IL-33作用下胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的比較 阿霉素組胃癌細(xì)胞增殖率低，不同質(zhì)量濃度IL-33處理的細(xì)胞增殖率變化不大；5-氟尿嘧啶組及依托泊苷培養(yǎng)組，不同IL-33質(zhì)量濃度下細(xì)胞增殖率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；順鉑培養(yǎng)組，60、80 ng/L IL-33處理與不添加IL-33（0 ng/L）相比，胃癌細(xì)胞增殖率均升高（均P＜0.05）。即在IL-33質(zhì)量濃度≥60 ng/L時(shí)，胃癌細(xì)胞可能出現(xiàn)順鉑耐藥性。見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度IL-33處理下，胃癌細(xì)胞對(duì)4種化療藥物敏感性的比較

2.3 IL-33處理下胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑及自噬抑制劑敏感性的比較 順鉑組，IL-33處理下胃癌細(xì)胞增殖率上升，即IL-33可能促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的增殖；給予自噬抑制劑3-MA后，20、40、80 ng/L IL-33處理下胃癌細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見3-MA有逆轉(zhuǎn)IL-33對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的作用。見圖3。

圖3 IL-33對(duì)順鉑及自噬抑制劑共培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞增殖率的影響

2.4 不同質(zhì)量濃度IL-33對(duì)胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與0 ng/L IL-33組比較 ，20、40、80 ng/L的IL-33處理胃癌細(xì)胞，自噬相關(guān)蛋白LC3A/B和Beclin1的相對(duì)表達(dá)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 IL-33對(duì)胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（a：自噬相關(guān)蛋白電泳圖；b：Beclin蛋白的相對(duì)表達(dá)量；c：LC3A/B蛋白的相對(duì)表達(dá)量）

2.5 IL-33對(duì)胃癌細(xì)胞ST2表達(dá)的影響 順鉑組，胃癌細(xì)胞增殖率在24 h時(shí)最高；順鉑+IL-33組，細(xì)胞增殖率持續(xù)上升，36 h時(shí)才達(dá)到最高值；至培養(yǎng)的第36 h開始，順鉑+IL-33+iST2-1組與順鉑＋I(xiàn)L33組細(xì)胞增殖率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5a。提示iST2-1逆轉(zhuǎn)了IL-33對(duì)順鉑處理的胃癌細(xì)胞增殖率的抑制作用。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，順鉑+IL33組LC3A/B及Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；順鉑組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，順鉑+IL33組ST2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與順鉑+IL33組比較，順鉑+IL-33+iST-2組ST2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。可見ST2的抑制劑iST2-1能夠有效逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞自噬蛋白的提高，見圖5b-c。

圖5 IL-33對(duì)胃癌細(xì)胞ST2及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（a：4組細(xì)胞增殖率；b：ST2和自噬相關(guān)蛋白電泳圖；c：ST2和自噬相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量）

3 討論

IL-33是IL-1細(xì)胞因子家族的新成員[9]，在免疫細(xì)胞、胃、肺和前列腺等不同組織中都有表達(dá)，生物學(xué)活性廣泛；除可以活化Th1，Th2，CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK）等細(xì)胞外，IL-33還被認(rèn)為是一種損傷相關(guān)分子模式分子[10]，在組織修復(fù)、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病、感染性疾病和癌癥中發(fā)揮重要作用[11]。本研究用不同質(zhì)量濃度IL-33處理胃癌細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高劑量IL-33提高了胃癌細(xì)胞增殖率，這提示IL-33的存在可能對(duì)胃癌具有促進(jìn)作用。順鉑是胃癌治療的經(jīng)典藥物，本研究發(fā)現(xiàn)：不同質(zhì)量濃度IL-33處理下，與順鉑共培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞增殖率上升，這提示IL-33能提高胃癌細(xì)胞的順鉑耐藥性，即IL-33誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗。

自噬受一系列自噬相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控，是至關(guān)重要的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程，通常在不利的微環(huán)境壓力下激活[12]。在饑餓、缺氧或其他特定的細(xì)胞應(yīng)激條件（如化療藥物等）下，有缺陷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器可通過該過程降解和再循環(huán)來應(yīng)對(duì)壓力，為腫瘤細(xì)胞生長提供有利條件。自噬被激活能夠介導(dǎo)化療中某些癌細(xì)胞獲得性耐藥表型。研究表明：上調(diào)不同腫瘤細(xì)胞系的自噬會(huì)增強(qiáng)腫瘤對(duì)包括放射療法、化學(xué)療法和靶向療法在內(nèi)的抗癌療法的抵抗力[13]。對(duì)胃癌細(xì)胞的順鉑耐藥性研究表明：抑制甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的自噬抑制作用能夠降低胃癌細(xì)胞的順鉑敏感性[14]。這說明自噬可能在胃癌細(xì)胞順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。自噬抑制可以使以前耐藥的癌細(xì)胞重新敏感，并增加化學(xué)治療劑的細(xì)胞毒性[14-15]。本研究檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3A/B的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IL-33處理下，胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白出現(xiàn)高表達(dá)，提示IL-33激活自噬；給予自噬抑制劑3-MA后，這些自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降。證實(shí)了IL-33處理下胃癌細(xì)胞通過自噬產(chǎn)生順鉑耐藥，而3-MA能有效逆轉(zhuǎn)IL-33作用下的胃癌細(xì)胞順鉑耐藥。

IL-33通過與特異性受體ST2結(jié)合后發(fā)揮功能。Zhou等[16]指出：腫瘤細(xì)胞與激活的成纖維細(xì)胞在TNF-α/IL-33/膜結(jié)合受體形式的ST2（ST2L）信號(hào)介導(dǎo)下相互作用，促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移。IL-33通過ST2-蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2）通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移[16]。Huang等[17]研究表明：ST2在胃癌組織中高表達(dá)。IL-33/ST2通過誘導(dǎo)細(xì)胞外調(diào)節(jié)ERK1/2、氨基末端激酶（c-Jun N-terminal protein kainse,JNK）和激活p38蛋白，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。因此，IL-33/ST2通路在胃癌進(jìn)展過程中發(fā)揮極其重要作用。本研究表明：IL-33處理后，順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞ST2出現(xiàn)顯著上調(diào)，給予iST2-1顯著降低ST2的蛋白相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量可見：在ST2抑制后，LC3A/B與Beclin1也隨即出現(xiàn)下調(diào)；結(jié)合MTT結(jié)果表明：胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性隨著ST2的抑制顯著增加。即IL-33極有可能是通過靶向ST2來介導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬從而產(chǎn)生順鉑耐藥。

綜上所述，本研究觀測(cè)了IL-33作用下胃上皮細(xì)胞與胃癌細(xì)胞的增殖率，發(fā)現(xiàn)IL-33可促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長；IL-33影響下胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥順鉑產(chǎn)生耐藥效應(yīng)，其機(jī)制是IL-33可誘導(dǎo)自噬發(fā)生，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的抵抗；ST2的抑制可逆轉(zhuǎn)IL-33帶來的自噬激活及順鉑耐藥效應(yīng)。IL-33/ST2途徑可為胃癌順鉑耐藥導(dǎo)致的治療失敗提供新的治療靶點(diǎn)及方向。