環絲氨酸聯合利福平和異煙肼對耐藥結核分枝桿菌體外作用效果的研究

陳勝杰 李 溪 李 超

1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科，廣東廣州 510405；2.廣東省佛山市婦幼保健院中心實驗室，廣東佛山 528000

根據世界衛生組織2019 年全球結核病的最新報告，全球潛伏性結核感染人群接近20 億，新發結核病患者996 萬例[1]。我國是全球結核病高負擔國家之一，結核病的防控仍然十分嚴峻[2]。由于耐藥結核分枝桿菌的產生及其引起的耐多藥結核病的持續流行，一線抗結核藥物已不能滿足臨床的治療需求[3-4]。開展潛在有效抗結核藥物十分重要[5-6]。環絲氨酸（D-Cycloserine，DCS）是廣譜二線抗結核藥物，能夠抑制結核分枝桿菌生長，是代表性潛在藥物[7-8]。2011 年世界衛生組織已推薦將DCS 用于耐多藥結核病的治療[9]。近年，伊朗、南非等國家采用DCS 治療耐多藥結核病取得了較好的效果[10-11]。同時，聯合藥敏試驗能夠評估藥物聯合作用時的抑菌或殺菌活性，指導臨床用藥[12-13]。但目前關于DCS 與一線藥物聯合效應的報道尚不多見。鑒于以上情況，本研究采用體外聯合藥敏實驗，探討DSC 與利福平（Rifampicin，RFP）和異煙肼（Isoniazid，INH）對耐藥結核分枝桿菌的體外作用效果。希望借此為臨床抗結核藥物配伍方案提供更多可靠合理的選擇。

1 材料與方法

1.1 菌株

結核分枝桿菌標準株（H37Rv，ATCC27294）和38株經菌種鑒定為結核分枝桿菌的臨床分離株為本室保存菌株。

1.2 試劑和耗材

7H9 培養基（M0178）和OADC（M0678）營養添加劑購自美國BD 公司；利福平（R3501）和異煙肼（I3377）購自美國Sigma 公司；Alamar Blue（R7017）購自美國AbD Serotec 公司；96 孔酶標板（M9410）購自美國Corning 公司。

1.3 藥物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定

采用微孔板Alamar blue 顯色法測定菌株對DCS、利福平和異煙肼的MIC[14]。具體步驟參照文獻[14]。96 孔板中每孔加入100 μl 7H9 培養基，采用倍比稀釋的方法得到藥物濃度梯度，同一行的各孔加入稀釋菌液100 μl；另做一塊空白板。在37℃培養箱中培養，從第6 天開始，空白板中加入顯色劑隔天觀察變色情況。MIC 定義為藍色完全沒有發生改變的最小藥物濃度。確定藥物MIC 后，倍比稀釋下進行聯合藥物試驗[15]。讀取結果并記錄單用和聯用MIC。

1.4 分級抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）計算與判讀標準

FICI=MIC A 藥聯用/MIC A 藥單用+MIC B 藥聯用/MIC B 藥單用；FICI≤0.5 為協同作用，0.5＜FICI≤4.0為無相關作用，FICI＞4.0 為拮抗作用[16]。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計軟件對藥物MIC 以及FICI進行數據分析，采用R 語言ggplot2 包可視化單用與聯用MIC 變化分布情況。

2 結果

2.1 藥物單用與聯用對耐藥結核分枝桿菌MIC 比較

38 株菌株MIC 見表1，與單獨用藥比較，DCS 分別與RFP 和INH 聯用后，78.9%和71.1%菌株MIC 降低。如表2 所示，DSC 與RFP 和INH 聯用后MIC50和MIC90 均明顯下降，DSC 與RFP 和INH 單用和聯用后各菌株MIC 對比分布箱線圖如圖1 所示，與單獨用藥比較，聯用MIC 呈明顯下降態勢。

圖1 DCS 與RFP 和INH 單用及聯用MIC 分布箱線圖

表1 38 株菌株DCS 與RFP 和INH 單用及聯用MIC（μg/ml）

表2 DCS 與RFP 和INH 單用及聯用MIC50 和MIC90（μg/ml，n=38）

2.2 聯合用藥FICI 指數

38 株菌株聯用FICI 分布見表3。兩種藥物聯合試驗均未檢測到對分離菌株的拮抗作用。聯合藥敏協同作用和無相關作用結果見圖2～3。

圖2 聯合藥敏協同作用結果示意圖（FICI=0.25+0.25=0.5）

表3 DCS 與RFP 和INH 聯用FICI 分布[例（%），n=38]

3 討論

圖3 聯合藥敏無相關作用結果示意圖（FICI=0.5+0.5=1）

當前，由于不規范、不合理用藥等因素加劇了耐多藥結核病的治療。尋找安全、有效的治療藥物是目前結核病研究的重要問題。聯合用藥能有效提高療效、降低藥物毒性和延緩耐藥性的產生，近幾年，采用聯合用藥治療耐多藥結核病已經成為一種重要的治療方案[17-18]。DCS 可有效破壞細菌細胞壁，干擾結核分枝桿菌合成，提高抗結核效果，有研究表明，該藥物臨床耐藥率較低，且與常規抗結核藥物聯合使用無交叉耐藥性，對結核耐藥菌株抗菌活性高[19-20]。Alamar blue顯色法可用于結核分枝桿菌RFP 和INH 耐藥性的快速檢測[21]，棋盤稀釋法是聯合藥敏的經典方法[22]。有研究顯示，采用棋盤稀釋法可準確評價以FICI 為基礎的體外藥物相互作用效果[23]。在體內外，抗菌藥物聯合效應包括協同、無關和拮抗。聯合藥敏實驗評估DCS 與RFP 和INH 抗結核的作用效果，為臨床結核病的治療管理提供實驗室理論依據。有研究發現，使用棋盤稀釋法評估胡椒堿和RFP、INH、乙胺丁醇、鏈霉素中任一種聯合使用的抗結核活性，是否具有協同性取決于聯合的藥物及研究的菌株，任何一組聯合藥物都不會對所有的結核菌株都表現為協同作用[24]，本研究也支持這一結果。本研究中DCS 與RFP 和INH 藥物配伍時雖然協同效應分別僅為18.4%和13.2%。但是值得注意的是24 株（63.2%）菌株的RFP 聯合MIC以及22 株（57.9%）菌株的INH 聯合MIC 降低數個濃度梯度，兩種聯合藥物方案均沒有發現拮抗效應，與單獨用藥比較，聯用MIC 呈明顯下降態勢，且聯合用藥后聯用MIC50 和MIC90 均下 降。DCS 與RFP 和INH 聯用均能不同程度地降低臨床耐藥株的耐藥性，從側面可推斷針對耐藥結核患者，采用DCS 聯合方案能在保證有效藥物濃度的前提下降低RFP 和INH的用藥濃度，進而降低藥物副作用。

綜上所述，DCS 與RFP 和INH 聯用，為耐多藥結核病的治療提供有益的實驗依據，可能成為未來研究抗結核分枝桿菌藥物相互作用的新選擇。然而體外試驗預測體內治療效果有其局限性[25]，因此更確切的實際聯合作用效果還需更進一步的臨床驗證。