蟛蜞菊內酯在不同條件下的降解動力學研究

張國琴，趙曉然，王冬萍，任曉亮，王 萌，劉 藝*

(1.天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617；2.天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301617)

蟛蜞菊內酯屬于香豆草醚類化合物，具有多酚內酯結構，主要存在于菊科醴腸屬植物醴腸全草中[1]，20世紀50年代，研究人員首次從金盞蟛蜞菊鮮葉中分離出該成分[2]。墨旱蓮主要含有黃酮、三萜、噻吩、香豆草醚、甾體、揮發油等化合物[3]，其中蟛蜞菊內酯為主要活性成分，2020年版《中國藥典》將其作為質量評價指標[4]，也是二至丸、參鹿補膏、涼血安神片等經典中成藥的主要藥效物質[5]。研究表明，蟛蜞菊內酯具有保肝[6-7]、抗炎[8]、抗氧化[9]、抗菌[10]等藥理作用，近年來研究發現該成分還具有抗腫瘤作用[11]，在治療乳腺癌[12]、前列腺癌[13]、腎癌[14]方面有良好的效果。

目前，對蟛蜞菊內酯藥理作用已展開了較全面的研究，但鮮有關于其穩定性的報道。因此，本實驗考察不同pH、溫度、光照、金屬離子、氧化條件下蟛蜞菊內酯含量隨時間的變化情況，并建立降解動力學模型，以期為墨旱蓮等含有該成分的中藥及相關制劑的生產、貯存提供參考依據。

1 材料

Acquity H-class超高效液相色譜(美國Waters公司)；SB-3200D數控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；AX224ZH電子天平[十萬分之一，奧豪斯儀器(上海)有限公司]；HH-2數顯恒溫水浴鍋(常州金壇良友儀器有限公司)；DELTA 320 PH儀(瑞士Mettler-Toledo公司)。蟛蜞菊內酯對照品(批號CHB180922，純度>98%，成都克洛瑪生物科技有限公司)。乙腈、甲醇[色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；鹽酸(分析純，天津化學試劑一廠)；甲酸(色譜純，美國Roe Scientific Inc公司)；氯化鐵、氯化亞鐵[分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司]；氫氧化鈉、氯化鈉(分析純，天津市大茂化學試劑廠)；3%H2O2(分析純，河北吉捷生物科技有限公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

2 方法

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%～15%B；5～15 min，15%～17%B；15～30 min，17%～30%B)；體積流量0.2 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長230 nm。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取蟛蜞菊內酯對照品5.00 mg，置于5 mL棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得(質量濃度為1.00 mg/mL)，避光，在4 ℃下靜置保存。

2.3 穩定性研究

2.3.1 pH值 精密量取“2.2”項下對照品溶液200 μL，置于10 mL棕色量瓶中，用氫氧化鈉、鹽酸配制的不同pH值溶液定容至刻度，分別調節pH值為3.0、5.0、6.2、8.0(實驗室所用純水pH值為6.2)，制成20 μg/mL溶液，置于37 ℃水浴中避光保存，間隔一定時間取樣，UPLC法測定蟛蜞菊內酯含量，通過R2確定反應級數，計算降解半衰期。

2.3.2 溫度 精密量取“2.2”項下對照品溶液200 μL，置于10 mL棕色量瓶中，純水定容至刻度，制成20 μg/mL溶液，分別置于37、60、80 ℃水浴中避光加熱，間隔一定時間取樣，UPLC法測定蟛蜞菊內酯含量，通過R2確定反應級數，計算降解半衰期。

2.3.3 光照 精密量取“2.2”項下對照品溶液200 μL，置于10 mL棕色量瓶中，純水定容至刻度，制成20 μg/mL溶液，在室溫下分別置于日光燈(1.55×106lx)、紫外燈(8.16×105lx)、避光處，間隔一定時間取樣，UPLC法測定蟛蜞菊內酯含量，通過R2確定反應級數，計算降解半衰期。

2.3.4 金屬離子 精密量取“2.2”項下對照品溶液200 μL，置于10 mL棕色量瓶中，分別用0.1 mol/L FeCl3、FeCl2溶液、純水定容至刻度，制成20 μg/mL溶液，置于80 ℃水浴中避光加熱，間隔一定時間取樣，UPLC法測定蟛蜞菊內酯含量，通過R2確定反應級數，計算降解半衰期。

2.3.5 氧化 精密量取“2.2”項下對照品溶液200 μL，置于10 mL棕色量瓶中，分別用純水、3%H2O2溶液定容至刻度，制成20 μg/mL溶液，在室溫下避光靜置，間隔一定時間取樣，UPLC法測定蟛蜞菊內酯含量，通過R2確定反應級數，計算降解半衰期。

2.5 數據處理 通過Origin 9.65軟件進行線性回歸分析，并繪制圖表。

3 結果

3.1 pH值對蟛蜞菊內酯穩定性的影響 表1、圖1顯示，一級動力學擬合的R2最大，表明擬合效果最優，并且降解屬于偽一級反應；半衰期分別為51.34、27.62、18.10、10.30 h；在pH值為3.0時，加熱48 h后蟛蜞菊內酯殘留率為53.46%，表明該成分在酸性條件下較穩定。

表1 不同pH值下蟛蜞菊內酯降解動力學參數Tab.1 Degradation kinetic parameters for wedelolactone under different pH values

圖1 pH值對蟛蜞菊內酯穩定性影響Fig.1 Effect of pH value on the stability of wedelolactone

3.2 溫度對蟛蜞菊內酯穩定性的影響 表2、圖2顯示，在37、80 ℃下一級動力學擬合的R2最大，50 ℃下二級動力學擬合的R2最大；為了統一比較半衰期，將蟛蜞菊內酯在各溫度下的降解均歸屬為偽一級反應，結果分別為18.10、3.10、1.71 h；在37 ℃下加熱48 h后蟛蜞菊內酯殘留率為14.40%，而在80 ℃下加熱6.5 h后僅為6.34%，表明該成分在低溫下更為穩定。

表2 不同溫度下蟛蜞菊內酯的降解動力學參數Tab.2 Degradation kinetic parameters for wedelolactone under different temperatures

圖2 溫度對蟛蜞菊內酯穩定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of wedelolactone

3.3 光照對蟛蜞菊內酯穩定性的影響 表3、圖3顯示，在紫外光下一級動力學擬合的R2最大，避光下二級動力學擬合的R2最大，日光下零級動力學擬合的R2最大；為了統一比較半衰期，將蟛蜞菊內酯在不同光照下的降解均歸屬為偽一級反應，結果分別為693.15、26.06、43.05 h；蟛蜞菊內酯在避光下放置12 h后殘留率為88.49%，高于日光、紫外光下，表明該成分應在避光條件下保存。

3.4 金屬離子對蟛蜞菊內酯穩定性的影響 表4、圖4顯示，在Fe2+溶液中一級動力學擬合的R2最大，降解屬于偽一級反應；半衰期分別為0.01、0.14、2.30 h；蟛蜞菊內酯在Fe3+溶液中加熱約10 min后基本全部降解，在Fe2+溶液中加熱1 h后殘存率僅為0.65%，表明該成分在含Fe3+、Fe2+溶液中穩定性較差，即應避免接觸含鐵容器。

表3 不同光照下蟛蜞菊內酯降解動力學參數Tab.3 Degradation kinetic parameters for wedelolactone under different illuminations

圖3 光照對蟛蜞菊內酯穩定性影響Fig.3 Effect of illumination on the stability of wedelolactone

3.5 氧化對蟛蜞菊內酯穩定性的影響 表5、圖5顯示，蟛蜞菊內酯在水中一級動力學擬合的R2最大，在3%H2O2中二級動力學擬合的R2最大；為了統一比較半衰期，將蟛蜞菊內酯在氧化下的降解均歸屬為偽一級反應，結果分別為693.15、12.88 h；蟛蜞菊內酯在3%H2O2中加熱10 h后殘存率僅為8.29%，表明該成分在上述溶液中的穩定性較差。

表4 不同金屬離子下蟛蜞菊內酯降解動力學參數Tab.4 Degradation kinetic parameters for wedelolactone under different metal ions

表5 氧化下蟛蜞菊內酯的降解動力學參數Tab.5 Degradation kinetic parameters for wedelolactone under oxidation

圖4 金屬離子對蟛蜞菊內酯穩定性影響Fig.4 Effect of metal ion on the stability of wedelolactone

圖5 氧化對蟛蜞菊內酯穩定性影響Fig.5 Effect of oxidation on the stability of wedelolactone

4 討論

中藥制劑生產過程涉及從原材料選擇到加工多個環節，其有效成分在生產、貯存期間可能由于環境的變化而影響自身穩定性[15-16]，進而影響藥物安全性和有效性。本實驗發現，蟛蜞菊內酯在多種物理、化學環境中均不穩定，而且在不同條件下的降解均符合偽一級反應，它具有鄰苯二酚結構，呈弱酸性，Fe2+可與其結構部分螯合，形成穩定的五環配合物[17]，其分子結構被破壞可能是由于高溫，或者其結構中含有的酚基團具有還原性，可與部分氧氣發生反應[18]，因此，該成分應在低溫避光環境下保存，并避免接觸堿性環境、氧化劑、鐵離子。今后，將對蟛蜞菊內酯降解產物及其機理進行深入研究，以期為更合理有效地開發利用墨旱蓮等含有該成分的中藥提供依據。