UHPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定地格達(dá)-4味湯中化合物及入血成分

田 香，拉喜那木吉拉，哈日呼，李軍茂，歐陽 輝，羅曉健*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥研發(fā)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，內(nèi)蒙古 通遼 028000；4.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006；5.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006)

蒙藥地格達(dá)-4味湯始載于《四部醫(yī)典》，被收錄于《內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)》《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》，由紫花地丁、胡黃連、梔子、瞿麥組成，是蒙醫(yī)治療膽囊炎的經(jīng)典名方，臨床應(yīng)用廣泛[1-2]，功效清“協(xié)日”、涼血、調(diào)糟歸精等，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、利膽、改善免疫及抗肝損傷、降壓、降脂等作用[3-4]，但目前鮮有報(bào)道該方整體化學(xué)成分開發(fā)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS法對地格達(dá)-4味湯化合物和入血成分進(jìn)行分析，以期為該方質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Nexera X2 LC-30A型超高效液相色譜儀(日本島津公司)；Q-TOF 5600 型高分辨質(zhì)譜儀(美國AB公司，配置ESI離子源、Analyst TF 1.6數(shù)據(jù)處理軟件、PeakView數(shù)據(jù)處理軟件)；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；ML3002E/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司]；VORTEX3型旋渦混勻器(德國IKA公司)；GZLY-1型冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；HB43-S型快速水分測定儀[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試劑與藥物 紫花地丁(批號(hào)190919)、梔子(批號(hào)190923)、胡黃連(批號(hào)190320)、瞿麥(批號(hào)199011)飲片均購于江西江中中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)劉勇教授鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》一部相關(guān)規(guī)定。地格達(dá)-4凍干粉(自制，批號(hào)20191225)。秦皮乙素(批號(hào)Q-022-190308，純度>99.9%)、梔子苷(批號(hào)110759-201908，純度>98.6%)、胡黃連苷Ⅰ(批號(hào)110707-201904，純度>96.6%)、胡黃連苷Ⅱ(批號(hào)110196-201902，純度>96.4%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。氯化鈉注射液(浙江國鏡藥液有限公司)。羧甲基纖維素鈉(上海山浦化工有限公司)。甲酸為色譜純(阿拉丁試劑有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(美國Thermo Fisher公司)；其余試劑均為分析純；純凈水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.3 動(dòng)物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK(湘)2019-0004，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，給藥前禁食12 h，自由飲水。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 精密稱取梔子苷、秦皮乙素、胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌犯?0 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 水煎液制備 按處方比例1∶1∶1∶1稱取紫花地丁、梔子、胡黃連、瞿麥，粉碎，過4號(hào)篩，混勻，稱取5.0 g，加300 mL水浸泡15 min，煎煮2 5 min，濾過，取適量至10 mL量瓶中，加水定容至刻度，混勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 凍干粉制備 將“2.2”項(xiàng)下水煎液在60 ℃下減壓濃縮至1 mg/mL左右生藥量，置于冷凍干燥箱中凍干，即得。

2.4 生物樣品采集 采集大鼠空白血漿，再灌胃給予“2.3”項(xiàng)下凍干粉的CMC-Na混懸液(劑量2.01 g/kg)，于0.5、1、2、4、6、12 h 眼眶取血各0.5 mL，置于1.5 mL肝素化的離心管中，取血后立即在 4 ℃、4 000 r/min下離心10 min，取上層血漿，保存在-40 ℃冰箱中。

2.5 生物樣品處理 取“2.4”項(xiàng)下大鼠空白血漿及各時(shí)間點(diǎn)含藥血漿各200 μL，加1 mL甲醇沉淀，渦旋混勻1 min，在4 ℃、13 000 r/min下離心15 min，取上層清液，在室溫下氮?dú)獯蹈桑?0 μL 20%甲醇復(fù)溶，渦旋混勻1 min，在4 ℃、13 000 r/min下離心15 min，取上清液進(jìn)行分析。

2.6 數(shù)據(jù)處理 采用 PeakView 1.6軟件中的XICManager，對 UPLC-Q-TOF-MS所采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2.7 化合物鑒定條件

2.7.1 色譜 Welch C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0.1～2 min，5%B；2～15 min，5%～30%B；15～27 min，30%～90%B；27～28 min，90%～5%B；28～30 min，5%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.7.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 250；噴霧電壓-4 500 V；霧化氣溫度550 ℃；氣簾氣35 psi(1 psi=6.895 kPa)；輔助氣、霧化氣50 psi；碰撞能量(CE) 30 eV。TOF/MS一級(jí)預(yù)掃描、二級(jí)掃描TOF/MS/MS離子累積時(shí)間分別為100、1 150 ms；觸發(fā)二級(jí)掃描方法為信息依賴掃描(IDA)，條件為多重質(zhì)量虧損(MMDF)、動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)，滿足者優(yōu)先進(jìn)行。

2.8 入血成分鑒定條件

2.8.1 色譜 Welch C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0.1～2 min，5%B；2～25 min，5%～95%B；25.1～30 min，5%～0B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.8.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 250；噴霧電壓-4 500 V；霧化氣溫度550 ℃；氣簾氣35 psi；輔助氣、霧化氣50 psi；碰撞能量(CE)10 eV。TOF/MS一級(jí)預(yù)掃描、二級(jí)掃描TOF/MS/MS離子累積時(shí)間分別為100、1 150 ms，觸發(fā)二級(jí)掃描的方法為信息依賴掃描(IDA)，條件為多重質(zhì)量虧損(MMDF)、動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)，滿足者優(yōu)先進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 化合物鑒定 UHPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖見圖1，結(jié)果見表1，共確定了53個(gè)色譜峰，通過質(zhì)譜信息、文獻(xiàn)[5-8]報(bào)道、精確分子量比對，可知對應(yīng)的化合物為黃酮、環(huán)烯醚萜、異黃酮，并鑒定了其中4個(gè)，分別為梔子苷(峰1)、秦皮乙素(峰10)、胡黃連苷Ⅱ(峰13)、胡黃連苷Ⅰ(峰17)。

圖1 化合物UHPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖Fig.1 UHPLC-Q-TOF-MS/MS total ion current chromatogram of compounds

峰1：母離子m/z433.134 0中性丟失糖基(C6H10O5)產(chǎn)生碎片離子m/z225.076 9，其碎片離子進(jìn)一步中性丟失H2O產(chǎn)生碎片離子m/z175.039 7，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，推測該化合物為梔子苷，其二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖2。

圖2 峰1二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.2 Secondary MS spectra and fragmentation pathway of Peak 1

峰10：母離子m/z177.019 7分別中性丟失CO2、CO，產(chǎn)生碎片離子m/z133.030 0、149.024 4，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，推測該化合物為秦皮乙素，其二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖3。

圖3 峰10二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.3 Secondary MS spectra and fragmentation pathway of Peak 10

峰13：母離子m/z511.145 2中性丟失糖基(C6H10O5)產(chǎn)生碎片離子m/z349.092 3，進(jìn)一步中性丟失C9H10O4產(chǎn)生碎片離子m/z 167.035 0，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，推測該化合物為胡黃連苷Ⅱ，其二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖4。

圖4 峰13二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.4 Secondary MS spectra and fragmentation pathway of Peak 13

峰17：母離子m/z537.160 6中性丟失C15H20O9產(chǎn)生碎片離子m/z147.045 4，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，推測該化合物為胡黃連苷Ⅰ，其二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖5。

表1 化合物鑒定結(jié)果Tab.1 Results of compound identification

續(xù)表1

圖5 峰17二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.5 Secondary MS spectra and fragmentation pathway of Peak 17

3.2 入血成分鑒定 UHPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖見圖6，結(jié)果見表2，以M2、M3、M15、M16、M26為例進(jìn)行解析。

圖6 入血成分UHPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖Fig.6 UHPLC-Q-TOF-MS/MS total ion current chromatogram of components absorbed into blood

M2：分子量比秦皮乙素多80 Da(SO3)，二級(jí)碎片離子m/z177.020 1、149.024 6、133.030 4與秦皮乙素一致，推測該入血成分為秦皮乙素磺酸化產(chǎn)物[11]，其二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖7。

圖7 M2二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.7 Secondary MS spectra and fragmentation pathway of M2

M3：分子量比秦皮乙素多176 Da(C6H8O6)，二級(jí)碎片離子m/z177.020 1、149.024 6、133.030 4與秦皮乙素一致[12]，推測該入血成分為秦皮乙素葡糖糖醛酸化產(chǎn)物，其二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖8。

表2 入血成分鑒定結(jié)果Tab.2 Results of components absorbed into blood identification

圖8 M3二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.8 Secondary MS spectra and fragmentation pathway of M3

M15、M16：分子量比咖啡酸多176 Da(C6H8O6)，二級(jí)碎片離子m/z179.035 0、135.045 0與咖啡酸一致[13-14]，推測該入血成分為咖啡酸葡糖糖醛酸化產(chǎn)物，其二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖9。

圖9 M15、M16二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.9 Secondary MS spectra and fragmentation pathway of M15 and M16

M26：分子量比原兒茶酸多94 Da(SO3+CH2)，二級(jí)碎片離子m/z167.035 6、152.012 1、108.022 8與原兒茶酸一致[15-16]，推測該入血成分為原兒茶酸甲基化和磺酸化結(jié)合產(chǎn)物，其二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖10。

圖10 M26二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.10 Secondary MS spectra and fragmentation pathway of M26

4 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS法結(jié)合PeakView軟件對蒙藥地格達(dá)-4味湯化合物和入血成分進(jìn)行分析，參考文獻(xiàn)[5-8]、數(shù)據(jù)庫匹配、二級(jí)質(zhì)譜分析，共鑒定出53個(gè)化合物，主要為黃酮、環(huán)烯醚萜、香豆素、異黃酮等，其中梔子、胡黃連中環(huán)烯醚萜具有明顯的保肝利膽、抗菌、消腫鎮(zhèn)痛、抗病毒等多種藥理活性[17-18]；紫花地丁中香豆素具有明顯的抗炎、抑菌、保肝等作用[19]；瞿麥中大黃素具有抗菌、抗炎等作用，但其含量很低[20]。再基于湯劑所含成分和文獻(xiàn)[21-25]中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，在大鼠灌胃給藥后入血成分中共鑒定出38個(gè)化合物及其相應(yīng)結(jié)構(gòu)，包括梔子苷、胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ等原型成分，以及秦皮乙素、原兒茶酸、咖啡酸相關(guān)代謝產(chǎn)物；代謝產(chǎn)物以Ⅱ相為主，反應(yīng)途徑涉及脫水、甲基化、葡萄糖全酸化、硫酸化結(jié)合反應(yīng)，均可能是在體內(nèi)產(chǎn)生藥效作用的物質(zhì)，具有治療膽囊炎、膽結(jié)石癥的藥理作用。另外，體內(nèi)移行成分來自地格達(dá)-4味湯中的君、臣、佐藥味，體現(xiàn)了復(fù)方中藥配伍協(xié)同作用的特點(diǎn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對蒙藥地格達(dá)-4味湯化合物和入血成分進(jìn)行了比較全面系統(tǒng)地分析，豐富了該方組成信息，可為今后其主要活性物質(zhì)分析及定量控制指標(biāo)研究奠定基礎(chǔ)。