痛瀉要方對肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎大鼠脂質代謝及自噬的影響

張旭飛，羅運鳳，高 潔，陳云志*，蔣志濱

(1.貴州中醫藥大學研究生院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州中醫藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025)

潰瘍性結腸炎是一種局限于結腸黏膜和黏膜下層的特發性炎癥[1]，中醫學按癥狀統歸為“久痢”范疇[2]。祖國醫學認為“肝與大腸相通”，這與現代醫學“肝腸軸”學說有異曲同工之處，肝與大腸在生理病理上互為因果[3]。肝臟硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)、腸道5-羥色胺(5-HT)均與潰瘍性結腸炎發生發展密切相關[4]，課題組前期通過實驗研究，發現肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎大鼠既有結腸病理改變，也存在肝臟脂質代謝異常；痛瀉要方干預后可上調結腸5-HT轉運體(SERT)的蛋白表達，減少結腸5-HT分泌，抑制炎性因子表達，發揮抗炎作用[5-6]。

肝臟SCD1參與脂質代謝過程，是調節飽和脂肪酸轉化為不飽和脂肪酸的關鍵酶。細胞自噬與中醫“氣”的功能密切關聯，自噬功能失調會使內生實邪積聚，健脾補氣藥物可調節“氣”的功能影響細胞自噬水平，以維持內環境代謝穩態[7]。外周5-HT作用于肝臟受體調節脂質代謝，而肝細胞自噬與肝臟脂質代謝相互作用[8]。因此，本實驗將通過觀察痛瀉要方對肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎大鼠血清5-HT及肝臟5-HT2A受體(5-HT2AR)、SCD1、固醇調節元件結合蛋白-1(SREBP-1)、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、酵母Atg6同系物(Beclin1)蛋白表達的影響，聚焦肝臟脂質代謝穩態，進一步探討痛瀉要方對緩解期肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，60只，體質量(200±10)g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK(湘)2014-0011。實驗方案經貴州中醫藥大學動物實驗倫理審查委員會認證。

1.2 藥物 從北京同仁堂貴陽藥店有限責任公司購買中藥飲片，經貴州中醫藥大學藥學院嚴福林講師鑒定合格。按痛瀉要方經典配伍比例(6∶4∶3∶2)稱取炒白術、炒芍藥、炒陳皮、防風，在鍋中用蒸餾水浸泡半小時后，武火煮沸，文火煎煮30 min，將水煎液濃縮至100 mL，高、中、低劑量分別含生藥量為1、0.5、0.25 g/mL，置于4 ℃冰箱備用。

1.3 試劑 2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)(美國Sigma公司，貨號SLCG2384)；柳氮磺胺吡啶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號E1525058)；5-HT ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號E-EL-0033c)；蘇木素染液、伊紅染液(武漢賽維爾生物技術有限公司，貨號G1005-1、G1001)；油紅O(合肥博美生物科技有限責任公司，貨號YO7512)；兔多抗GAPDH(杭州賢至生物科技有限公司，貨號AB-P-R001)；兔多抗5HT2AR[愛必信(上海)生物科技有限公司，貨號Abs138420]；鼠單抗SCD1[艾博抗(上海)貿易有限公司，貨號Ab19862]；兔多抗SREBP-1、Beclin1(江蘇親科生物研究中心有限公司，貨號Af6283、Af5128)；兔單抗LC3(美國Cell Signaling Technology公司，貨號2775)。

1.4 儀器 微型高速離心機(美國Labnet公司)；離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；電熱恒溫培養箱(日本ASONE公司)；全自動酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；水平搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器廠)；轉輪式切片機(德國徠卡公司)；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)。

2 方法

2.1 模型建立 60只SD大鼠適應性喂養1周，分別稱體質量并標記，隨機分為正常組(8只)和造模組(52只)。參照經典的肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎造模法，采取TNBS/乙醇溶液灌腸聯合束縛應激+飲食失節，建立動物疾病模型[9-10]。將造模組大鼠禁錮于鼠籠中，并將其雙前肢反捆至背部以限制其活動，每天捆綁束縛2次，每次進行45 min，并隔日足量或半量喂養飼料，模擬飲食失節，連續造模2周。將造模大鼠禁食1天后，使用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射進行麻醉，利用灌腸管將100 mg/kg TNBS與0.25 mL 50%乙醇混合溶液緩慢注入距離大鼠肛門約8 cm處深的結腸部位，固定大鼠尾部片刻，短暫夾閉肛門，使大鼠保持平躺姿勢，蘇醒后送回動物房繼續飼養，灌腸1次；正常組大鼠則以上述操作注入相同體積的0.9%氯化鈉生理鹽水。

2.2 分組及給藥 60只大鼠隨機分為正常組8只，造模組52只，其中造模組在進行捆綁束縛及灌腸后，由于骨折、感染、相互撕咬等情況死亡10只，另外抽取2只進行病理觀察評價。確定造模成功后，把40只造模組大鼠隨機分為模型組、柳氮磺胺吡啶組及痛瀉要方高、中、低劑量組，每組8只，給予藥物灌胃。痛瀉要方高、中、低劑量組分別按每天10、5、2.5 g/kg劑量灌胃(按人與大鼠體表面積折算[11]，相當于60 kg成人每日劑量的12、6、3倍)痛瀉要方；柳氮磺胺吡啶組按每天0.3 g/kg灌胃柳氮磺胺吡啶；正常組、模型組均以等量0.9% 氯化鈉水溶液進行灌胃，各給藥組大鼠連續給藥3周，每天1次。

2.3 肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎動物模型評價指標

2.3.1 宏觀表征 主要從大鼠精神狀態、攝食改變、活動規律、皮毛色澤、體質量變化、糞便形態等方面進行觀察，是評價動物模型的基本要素以及評定動物證候屬性的方法，同時是探討病證結合動物模型的關鍵環節[12]。宏觀表征是動物四診信息的直接體現，肝郁脾虛證動物會出現皮毛干枯無光澤、靜臥少動、乏力、食少便溏等宏觀表征，可作為評估肝郁脾虛證的四診指標[13]。

2.3.2 疾病活動指數(DAI)評分 潰瘍性結腸炎的臨床表征主要為體質量減輕、稀便、便血，通過對模型動物這3項指標的評分，可以初步了解動物病癥發展的嚴重程度，是評價動物潰瘍性結腸炎模型的重要方法[14]。

2.3.3 行為學實驗 曠場實驗，利用動物在空曠場地中對新異環境的恐懼，與對新異事物的探究本性所產生的沖突行為，來評價模型的情緒狀態[15]；高架十字迷宮實驗，利用動物對新異環境的探究本性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態，是動物焦慮行為學研究中較為經典的測試[16]。不同疾病肝郁脾虛證在臨床中常出現情志類癥狀，因此在動物模型中常選用曠場實驗和高架十字迷宮實驗等行為學指標評價肝郁脾虛證[17]。

2.3.4 結腸組織病理學 結腸病理顯示炎性細胞浸潤、杯狀細胞減少、腺體破壞及潰瘍形成等一系列變化，可確定潰瘍性結腸炎動物模型成立[18]。

2.4 宏觀表征觀察和DAI評分 在造模前、給藥前、給藥3周后，觀察大鼠精神狀態、毛發色澤、行為體態；記錄大鼠體質量、大便性狀，采用鄰聯甲苯胺法檢測糞便隱血，作DAI評分。DAI評分參照文獻[19]標準，DAI=(體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數)/ 3，見表1。

2.5 曠場實驗和高架十字迷宮實驗觀察大鼠行為狀態 曠場實驗，將大鼠放置于曠場中央區域，記錄其5 min內總運動距離和中央區域停留時間。高架十字迷宮實驗，記錄大鼠5 min內開臂停留時間、進入開臂次數、閉臂停留時間、進入閉臂次數并計算開臂停留時間、進入開臂次數百分比。

表1 大鼠DAI評分標準Tab.1 DAI scoring criteria for rats

2.6 大鼠組織標本采集 給藥、DAI評分及行為學實驗結束后，注射2%戊巴比妥鈉(2.5 mL/kg)進行麻醉，隨后腹主動脈取血，靜置30 min后，3 000 r/min低溫離心15 min，分離收集血清，置于-80 ℃冰箱存放備用。摘取大鼠結腸、肝臟組織，分別4%多聚甲醛儲存及-80 ℃保存。

2.7 HE、油紅O染色法分別觀察大鼠結腸與肝臟組織病理學變化 大鼠結腸組織、肝臟組織經4%多聚甲醛固定、脫水、包埋、切片，分別進行HE染色和油紅O染色，光學顯微鏡下觀察結腸組織形態結構和肝臟組織脂質沉積，并對結腸組織進行評分，評分標準參照文獻[20]，見表2。

表2 潰瘍性結腸炎炎癥分級評分標準Tab.2 Grading and scoring standards for ulcerative colon

2.8 ELISA法檢測大鼠血清5-HT水平 按照ELISA試劑盒說明書進行檢測，在96孔酶標板內進行操作，經過顯色后在酶標儀內以450 nm波長依序檢測各孔OD值并根據標準曲線獲得樣品檢測目標的濃度。

2.9 Western blot檢測大鼠肝臟5-HT2AR、SCD1、SREBP-1、LC3、Beclin1蛋白表達 按照試劑盒說明提取肝臟蛋白后，取上清液分裝并置于-20 ℃保存，根據蛋白樣品OD值，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。配置10% SDS-PAGE凝膠，上樣后進行電泳、轉膜，用TBST封閉2 h，加入內參GAPDH一抗(1∶1 000)，5-HT2AR、SCD1、SREBP1、LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入相應的二抗(1∶50 000)，37 ℃搖床孵育2 h。最后顯色曝光，掃描膠片，用IPP分析膠片灰度值。

3 結果

3.1 宏觀表征觀察和DAI評分 正常組大鼠精神活躍，毛發整齊光澤，活動性強，灌胃時抵抗強烈，糞便呈褐色顆粒狀且干稀適中；模型組大鼠時而易怒狂躁，時而萎靡不振，出現拖尾，毛發凌亂且色澤干枯晦暗，扎堆少動且蜷伏角落，灌胃時抵抗減弱，糞便稀溏伴有膿血；給藥組大鼠精神狀態良好但偶有易怒表現，毛發雖凌亂但逐漸恢復光澤，活動增加，時喜扎堆，糞便雖時有稀溏但逐漸成形，質地變干。

各組大鼠DAI評分結果顯示，給藥前，各造模組之間無顯著性差異(P>0.05)，與正常組比較，各造模組大鼠DAI評分均升高(P<0.01)；給藥3周后，各給藥組大鼠DAI評分均降低(P<0.01)，以痛瀉要方中劑量組及柳氮磺胺吡啶組評分降低最為明顯，而痛瀉要方高劑量組次之。見表3。

表3 各組大鼠DAI評分(分，Tab.3 DAI scores of rats in each

3.2 曠場實驗和高架十字迷宮實驗 曠場實驗結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠總運動距離減少，中央區域停留時間降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠總運動距離增加，中央區域停留時間增加(P<0.05，P<0.01)，以痛瀉要方中劑量組和柳氮磺胺吡啶組最為明顯。高架十字迷宮實驗結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠開臂停留時間和進入開臂次數百分比均降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠開臂停留時間和進入開臂次數百分比均升高(P<0.05，P<0.01)，以痛瀉要方中劑量組和柳氮磺胺吡啶組最為明顯。見表4。

表4 各組大鼠曠場實驗和高架十字迷宮實驗結果Tab.4 Results of open field test and elevated plus maze test of rats in each

3.3 大鼠結腸組織病理學變化 正常組大鼠結腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層形態結構完整且界限明晰，固有層內大腸腺排列較為密集，未見壞死和炎癥細胞浸潤；模型組大鼠大量腸段形成潰瘍灶，累及結腸全層，正常細胞結構消失，由大量滲出纖維素、黏液、壞死組織和大量中性粒細胞替代，炎癥細胞浸潤累及肌層；給藥組大鼠結腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層結構較完整，固有層內富含管狀腸腺。其中痛瀉要方高、中劑量組和柳氮磺胺吡啶組黏膜固有層內少量中性粒細胞或淋巴細胞浸潤；痛瀉要方中劑量組部分固有層和黏膜下層內見毛細淋巴管；痛瀉要方低劑量組部分腸腺變性、壞死及擴張，部分區域出現潰瘍灶，累及結腸全層，可見大量中性粒細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織HE染色(×100)Fig.1 HE staining of rat colon tissue in each group(×100)

潰瘍性結腸炎炎癥評分結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠炎癥評分升高(P<0.01)；與模型組比較，痛瀉要方高、中劑量組和柳氮磺胺吡啶組大鼠炎癥評分降低(P<0.01)。見表5。

表5 各組大鼠炎癥評分結果Tab.5 Results of inflammatory score of rats in each

3.4 大鼠肝臟組織脂質沉積變化 正常組大鼠肝臟組織中細胞核淺染，未見明顯橘紅色脂滴；與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織中脂滴形成增多，細胞漿可見大量大泡樣橘紅色脂滴，形態較大，形狀不規則且排列緊密，脂肪變性明顯；與模型組比較，痛瀉要方高、中劑量組及柳氮磺胺吡啶組肝臟組織脂滴水平減少，脂肪變性程度減輕。見圖2。

圖2 各組大鼠肝臟組織油紅O脂類染色(×400)Fig.2 Oil red O lipid staining of rats in each group(×400)

3.5 大鼠血清5-HT水平 如表6所示，模型組大鼠血清5-HT水平高于正常組(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清5-HT水平均降低(P<0.01)，痛瀉要方中劑量組和柳氮磺胺吡啶組降低趨勢最為明顯，痛瀉要方高劑量組次之。

表6 各組大鼠血清5-HT水平Tab.6 Serum 5-HT level of rats in each

3.6 大鼠肝臟5-HT2AR、SCD1、SREBP-1、LC3、Beclin1蛋白表達 與正常組比較，模型組大鼠肝臟SCD1蛋白表達降低(P<0.01)，5-HT2AR、SREBP-1、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，痛瀉要方中劑量組和柳氮磺胺吡啶組大鼠肝臟5-HT2AR蛋白表達降低(P<0.01)，痛瀉要方高、中劑量組和柳氮磺胺吡啶組肝臟SCD1蛋白表達升高(P<0.05，P<0.01)，SREBP-1、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)。見圖3、表7。

注：A為正常組，B為模型組，C為痛瀉要方高劑量組，D為痛瀉要方中劑量組，E為痛瀉要方低劑量組，F為柳氮磺胺吡啶組。圖3 各組大鼠肝臟5-HT2AR、SCD1、SREBP-1、LC3、Beclin1蛋白電泳圖Fig.3 Electrophoresis images for 5-HT2AR，SCD1，SREBP-1，LC3 and Beclin1 proteins in the liver of rats in each group

表7 各組大鼠肝臟5-HT2AR、SCD1、SREBP-1、LC3、Beclin1蛋白表達Tab.7 Protein expressions of 5-HT2AR，SCD1，SREBP-1，LC3 and Beclin1 in the liver of rats in each

4 討論

本實驗中模型大鼠與正常大鼠比較，宏觀表征改變，DAI評分較高；探究特性和好奇心行為減少；結腸組織全層形成潰瘍灶，炎癥評分升高，提示肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎大鼠模型造模成功。經痛瀉要方給藥后能改善大鼠肝郁脾虛癥狀，修復結腸病理損傷，抑制炎癥反應，對結腸具有保護作用。

外周5-HT及肝臟5-HT2AR介導著肝臟脂肪變性，調節脂質代謝穩態[21-22]。本實驗模型大鼠肝臟5-HT2AR表達升高，與血清5-HT變化趨勢一致，肝臟脂質沉積；痛瀉要方通過調控外周5-HT作用于肝臟5-HT2AR表達，減輕脂質沉積，從而影響肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎大鼠肝臟脂質代謝。

肝臟SCD1參與脂質代謝過程，是將飽和脂肪酸轉化為不飽和脂肪酸的關鍵酶，當二者平衡失調時會造成肝細胞應激損傷，加重腸道炎癥反應[23]。SREBP-1與肝臟脂肪變性密切關聯，是評價脂質代謝的關鍵指標[24]。SREBP-1可以激活SCD1參與脂質合成，二者間的表達具有相關性[25]，抑制肝臟SCD1表達會導致肝臟脂質代謝改變，影響脂肪生成轉錄因子SREBP-1表達[26]。本實驗模型大鼠肝臟脂質沉積，SCD1表達降低，而SREBP-1表達升高，結腸黏膜損傷和炎癥反應加重；痛瀉要方通過調節肝臟SCD1和SREBP-1表達，使飽和脂肪酸轉化為不飽和脂肪酸，平衡肝臟脂質代謝穩態，進而減輕肝細胞應激損傷，緩解潰瘍性結腸炎結腸黏膜損傷和炎癥反應。

Beclin1是自噬啟動的調節因子[27]，而LC3是反映自噬激活與否的重要標志物，包括LC3Ⅰ和激活的LC3Ⅱ。生理狀態下細胞內LC3Ⅰ呈常規表達，當各種應激反應激活自噬時，LC3Ⅰ轉化為自噬膜形式的LC3Ⅱ[28]，其蛋白表達已成為判斷自噬水平的主要標準[29]。脂滴是主要的脂質儲存形式[30]，自噬參與脂滴的分解代謝[31]，改善肝臟脂質代謝紊亂[32]。本實驗模型大鼠肝臟脂質沉積，LC3Ⅱ、Beclin1表達升高，提示肝臟脂質代謝紊亂會激活細胞自噬功能；痛瀉要方通過平衡肝臟脂質代謝穩態以及改變細胞自噬水平，影響腸道病理損傷。

綜上所述，潰瘍性結腸炎肝郁脾虛證的證候實質，一方面可能在于外周5-HT作用于肝臟5-HT2AR，抑制SCD1表達，升高SREBP-1表達，使飽和脂肪酸無法轉化為不飽和脂肪酸，影響二者動態平衡，導致肝臟脂質沉積增加，出現脂質代謝紊亂，造成肝細胞應激損傷，加重腸道病理損傷和炎癥反應；另一方面可能在于脾失健運，肝失疏泄致使膏脂蘊結于肝，出現肝細胞脂質代謝紊亂，激活肝細胞自噬功能。綜合各項檢測數據，痛瀉要方中劑量組給藥效果接近柳氮磺胺吡啶組，且優于高、低劑量組。由此可知痛瀉要方中劑量相對藥效活性最佳，其補脾柔肝的機制可能是通過調控外周5-HT作用于肝臟5-HT2AR表達，維持肝臟脂質代謝穩態以及改變肝細胞自噬水平，從而改善結腸組織病理變化，影響緩解期肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎。