蒲公英水提物對大鼠潰瘍性結腸炎的作用

毛葉勤，陳 琳*，吳 育，陳 剛

(1.蘇州大學附屬第一醫院藥學部，江蘇 蘇州 215006；2.南通市中醫院藥劑科，江蘇 南通 226000)

潰瘍性結腸炎是一種以黏膜和黏膜下持續炎癥為特征的慢性疾病，因機體免疫調節紊亂，難治愈，易復發[1]，目前該病已成為消化系統常見疾病和慢性腹瀉的主要病因，患者多為青壯年[2]。潰瘍性結腸炎的發病機制較復雜，腸損傷引起的免疫應答和炎癥細胞因子的過度表達可導致T細胞在炎癥的腸道內積聚，導致腸黏膜上皮屏障的損傷和功能障礙，最終觸發或加重其發生發展[3]。近年來，越來越多的臨床和實驗研究證明，具有多成分、多靶點的中藥輔助治療有利于緩解潰瘍性結腸炎癥狀，療效可靠，副作用少，復發率低。蒲公英含酚酸、黃酮、多糖等類活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗胃損傷、利膽保肝等作用[4]。臨床常用于呼吸道疾病、胃腸道炎癥、肝損傷、2型糖尿病等疾病的治療[5]。有研究證明蒲公英水提物可通過抗炎作用改善實驗性潰瘍性結腸炎大鼠癥狀，但對與潰瘍性結腸炎發病機制相關的免疫調節、黏膜愈合作用以及灌腸局部給藥的研究卻未見報導[6]。因此，本研究旨在通過三硝基苯磺酸聯合乙醇誘導的大鼠潰瘍性結腸炎模型，進一步研究蒲公英水提物對實驗性潰瘍性結腸炎大鼠免疫調節及促進黏膜愈合的作用，以期為蒲公英藥物在潰瘍性結腸炎臨床的治療提供一定理論依據。

1 材料

1.1 動物 36只SD大鼠，雄性，SPF級，體質量180～220 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產許可證為SCXK(滬)2017-0005，常規飼養于蘇州大學SPF級動物房，動物房溫度20～26 ℃，相對濕度40%～60%，12 h/12 h交替照明。所有實驗研究符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則，倫理批準號170373。

1.2 藥材來源及鑒定 蒲公英購于河北省安國市藥材市場，經南京中醫藥大學生藥學專業巢建國教授鑒定為菊科植物蒙古蒲公英TaraxacummongolicumHand-Mazz.的干燥全草。

1.3 試劑與藥物 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(批號021771，美國Sigma公司)；隱血試劑盒(批號20160824)、大鼠白介素-2(IL-2)(批號20170910)、白介素-8(IL-8)(批號20170910)、白介素-10(IL-10)(批號20170910)、白介素-17(IL-17)(批號20170910)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(批號20170912)、C反應蛋白(CRP)(批號20170911)、髓過氧化物酶(MPO)(批號20170915)、表皮生長因子(EGF)(批號20170917)、大鼠轉化生長因子-β(TGF-β)(批號20170917)均購自于南京建成生物工程研究所。水合氯醛(批號20150203，國藥集團化學試劑有限公司)；生理鹽水(批號A14081805，貴州順創和藥業有限公司)；無水乙醇(批號20131008，天津市福晨化學試劑廠)。

1.4 儀器 SpectraMax M2型多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)；先行者CP214型電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；T6新世紀紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；TLC16M型高速冷凍離心機(湖南湘立科學儀器有限公司)。

1.5 蒲公英水提物的制備 稱取蒲公英干燥全草100 g置于多功能提取罐，加入10倍量的水，煮沸提取3次，每次1 h，合并提取液，用400目濾布過濾，所得濾液用旋轉蒸發儀濃縮至稠浸膏狀后冷凍干燥，即得蒲公英水提物，得率為16.80%。

2 方法

2.1 實驗性潰瘍性結腸炎模型建立 大鼠適應性飼養1周后，禁食不禁水24 h，隨機選取6只大鼠作為正常組，剩余大鼠參照張漢超等[7]描述方法，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，然后將1根聚乙烯導管(長度為10 cm，外徑為2 mm)通過肛門小心地插入結腸管腔，其尖端位于肛門近端約8 cm處，使大鼠頭部向下，將0.3 mL 5% TNBS溶于0.3 mL 30%乙醇中，通過安裝在1 mL注射器上的導管緩慢注入管腔，緩緩拔出導管，使大鼠保持頭部朝下姿勢10 s，以確保TNBS-乙醇溶液在結腸內分布，隨后將大鼠放入籠中，仰臥位，待其自然蘇醒。正常對照組，平行操作，但僅用等體積的0.9%生理鹽水代替。

2.2 動物分組及給藥 TNBS造模后第1天，大鼠參考Hamamoto等[8]標準進行疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分，按照炎癥程度，極輕度炎癥(0～3分)、輕度炎癥(4～6分)、中度炎癥(7～9分)、重度炎癥(10～12分)對模型大鼠進行分組。剔除模型中評分最低(2只)和最高(4只)的大鼠，剩余大鼠按炎癥程度采用分層隨機抽樣的方式分為模型組、奧沙拉嗪(200 mg/kg)組和蒲公英水提物高(200 mg/kg)、低(100 mg/kg)劑量組，每組6只，造模后第8天開始灌腸給藥，正常組和模型組給予生理鹽水灌腸，蒲公英水提物各劑量組和奧沙拉嗪組給予相應藥物灌腸，每天1次，連續給藥14 d，于造模后第1、4、7、10、14、21天對各組大鼠造模后體質量、糞便性狀及隱血情況進行記錄，評價DAI評分的改善情況。

2.3 觀察指標及檢測方法 末次給藥后大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛(3.0 mL/kg)麻醉大鼠，腹主動脈取血，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取上層血清，用試劑盒檢測IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α、CRP水平。解剖取胸腺、肝臟、脾臟、肺臟等臟器，稱定質量，計算臟器指數。沿腸系膜緣剪開腸腔，預冷生理鹽水洗經腸內容物記錄結腸長度、寬度，稱定質量。參照表1標準[9]進行結腸黏膜損傷指數(colonmucosa damage index,CMDI)評分。將結腸組織縱向剪取一半稱定質量，按1∶9加入預冷生理鹽水勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液，用試劑盒檢測組織上清液中IL-2、EGF、MPO、TGF-β水平。剩余結腸用 40 g/L甲醛固定，制作病理切片，參照表1標準[10]進行病理組織學(histopathological score，HS)評分。

表1 結腸黏膜肉眼及鏡下評分標準Tab.1 Macroscopic and microscopic scoring standards for colonic mucosa

3 結果

3.1 蒲公英水提物對潰瘍性結腸炎大鼠DAI的影響 如表2所示，造模后第7天，與正常組比較，經TNBS灌腸處理的各組大鼠DAI評分升高(P<0.01)，提示造模成功，且各TNBS處理組間DAI評分無明顯變化(P>0.05)，提示給藥前各TNBS處理組大鼠炎癥程度基本一致。隨著奧沙拉嗪和蒲公英水提物給藥時間的延長，DAI評分呈逐漸降低趨勢。給藥14 d后(造模后第21天)，與正常組比較，模型組大鼠DAI評分升高(P<0.01)；與模型組比較，奧沙拉嗪組和蒲公英水提物高劑量組大鼠DAI評分降低(P<0.05)，蒲公英提取低劑量組大鼠DAI評分有下降趨勢(P>0.05)。

3.2 蒲公英水提物對潰瘍性結腸炎大鼠臟器指數的影響 如表3所示，與正常組比較，模型組大鼠肝臟指數、脾臟指數升高(P<0.01)，胸腺指數降低(P<0.01)；與模型組比較，奧沙拉嗪組和蒲公英水提物各劑量組大鼠肝臟指數無明顯變化(P>0.05)，胸腺指數升高(P<0.05，P<0.01)，脾臟指數降低(P<0.01)。

3.3 蒲公英水提物對潰瘍性結腸炎大鼠結腸相關檢測指標的影響 如表4所示，與正常組比較，模型組大鼠結腸長度縮短(P<0.01)，結腸長寬比降低(P<0.01)，CMDI和結腸指數升高(P<0.01)；與模型組比較，奧沙拉嗪組和蒲公英水提物各劑量組大鼠結腸長度和結腸長寬比增加(P<0.05，P<0.01)，CMDI和結腸指數降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠DAI評分Tab.2 DAI scores of rats in each

表3 各組大鼠臟器指數Tab.3 Organ indices of rats in each

表4 各組大鼠結腸相關指標Tab.4 Colon-related indicators of rats in each

3.4 蒲公英水提物對潰瘍性結腸炎大鼠血清炎癥因子的影響 如表5所示，與正常組比較，模型組大鼠血清IL-8、IL-17、CRP、TNF-α水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.01)。與模型組比較，奧沙拉嗪組和蒲公英水提物各劑量組大鼠血清IL-8、IL-17、CRP、TNF-α水平降低(P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.01)。

表5 各組大鼠血清IL-8、IL-10、IL-17、CRP、TNF-α水平Tab.5 Serum levels of IL-8,IL-10,IL-17,CRP and TNF-α of rats in each

3.5 蒲公英水提物對潰瘍性結腸炎大鼠結腸細胞因子的影響 如表6所示，與正常組比較，模型組大鼠結腸組織IL-2、MPO水平升高(P<0.01)，EGF、TGF-β水平降低(P<0.01)；與模型組比較，奧沙拉嗪組及蒲公英水提物各劑量組大鼠結腸IL-2、MPO水平降低(P<0.01)，EGF水平升高(P<0.01)，但TGF-β水平無明顯變化(P>0.05)。

3.6 蒲公英水提物對潰瘍性結腸炎大鼠結腸病理變化的影響 如表7、圖1所示，模型組病理圖片中大部分杯狀細胞和隱窩結構消失，有黏膜組織壞死、出血，大量炎細胞浸潤到黏膜肌層。與正常組比較，模型組大鼠結腸上皮細胞、炎細胞浸潤及HS總評分均增加(P<0.01)；與模型組比較，奧沙拉嗪組大鼠結腸上皮細胞評分、炎細胞浸潤評分、HS總評分均降低(P<0.01)，蒲公英水提物高劑量組的炎癥細胞浸潤評分和HS總評分降低(P<0.05)，蒲公英水提物高劑量組上皮細胞評分和低劑量組各病理評分均無明顯變化(P>0.05)。

表6 各組大鼠結腸 IL-2、MPO、EGF、TGF-β水平Tab.6 Colon tissue levels of IL-2,MPO,EGF and TGF-β of rats in each

表7 各組大鼠結腸病理評分Tab.7 HS scores of rats in each

圖1 各組大鼠結腸組織的病理學評分(HE,×200)Fig.1 Histopathological scores of colon tissue of rats in each group (HE，×200)

4 討論

潰瘍性結腸炎是由結腸組織持續性炎癥介導的，其特征是免疫細胞的強烈激活、促炎級聯反應和黏附分子的產生，最終導致腸黏膜上皮屏障的損害和功能障礙[11]。本研究結果顯示，經蒲公英水提物治療后顯著改善潰瘍性結腸炎大鼠一般臨床癥狀，結腸長度增加，腸黏膜表面較模型組光滑，潰瘍紅腫減少或消失，CMDI評分降低；鏡下檢查可見黏膜結構完整性得到改善，隱窩和上皮細胞丟失減少，炎細胞浸潤減輕，HS總評分降低。MPO已被用作結腸黏膜中炎癥和中性粒細胞浸潤的定量指標，其水平的降低可以解釋為抗炎性能的表現。蒲公英水提物能抑制結腸炎大鼠MPO的水平，提示炎性病變有所減輕。CRP是急性炎癥反應的代表性生物標志物，對人體的炎癥反應具有很高的敏感性，與患者內鏡活動呈正相關，經常被用來驗證潰瘍性結腸炎的緩解程度和黏膜愈合[12]。蒲公英水提物治療能降低CRP水平，提示黏膜愈合度得到改善。為進一步評價蒲公英水提物的促黏膜愈合作用機制，對結腸組織的促修復因子進行檢測，結果顯示，EGF水平升高，提示蒲公英水提物對潰瘍性結腸炎大鼠損傷黏膜具有保護作用。

IL-2由輔助性T淋巴細胞受刺激誘導分泌，其水平高低間接反映了宿主T淋巴細胞活化程度及宿主免疫系統清除衰老變性細胞、自體變性和損傷細胞方面的能力大小[13]。IL-8是一種強而有力的中性粒細胞活化和趨化因子，能夠促進中性粒細胞的溶酶體酶活性和吞噬作用，其檢測可作為臨床上判斷疾病嚴重程度和療效的指標[14]。TNF-α是與潰瘍性結腸炎關系最為密切的細胞因子，能引起細胞壞死、間質中蛋白質破壞和水腫的發生，促進胃腸細胞的組織損害及上皮細胞的凋亡[15-16]，加重黏膜損傷[17]。IL-10是重要的多效性免疫調節細胞因子，其主要抑制IL-2、IL-8、TNF-α等的分泌和調節免疫細胞的分化與增殖，減少可溶性TNF-α受體等抗炎蛋白的表達，從而限制和終止炎癥反應[18]。IL-17是由CD4+T細胞輔助亞群分泌的一種強促炎因子，研究發現潰瘍性結腸炎患者體內IL-17水平升高，且與疾病嚴重程度呈正相關[19-20]。在本研究中，經蒲公英水提物治療后，IL-8、IL-17、TNF-α和IL-2水平降低，IL-10水平升高。提示蒲公英水提物可以通過調節炎性細胞因子分泌，進而調節免疫反應平衡，減輕機體炎癥反應，最終達到緩解潰瘍性結腸炎的作用。

綜上所述，蒲公英水提物對TNBS誘導的實驗性潰瘍性結腸炎大鼠具有治療作用，以高劑量作用最佳，其機制可能與減輕結腸組織免疫炎性損傷，并通過提高促修復因子水平，促進損傷黏膜愈合，最終達到治療潰瘍性結腸炎的目的。