石菖蒲中乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選

方 洪，韓沅沅，谷麗華*，李林楠，楊 莉，吳其國，王崢濤

(1.上海中醫藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，國家中醫藥管理局中藥新資源與質量評價重點實驗室，上海 201203；2.上海中藥標準化研究中心，上海 201203)

乙酰膽堿(ACh)是中樞膽堿能系統中重要的神經遞質之一，其主要功能是維持意識的清醒，在學習記憶中起到重要作用，可被絲氨酸水解酶乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)水解為乙酸和膽堿，終止興奮刺激作用，保證神經信號分子在體內的正常傳導[1]。乙酰膽堿脂酶抑制劑(acetylcholinesterase inhibitor，AChEI)能對乙酰膽堿脂酶進行可逆性抑制，以減少突觸間隙乙酰膽堿的降解，達到乙酰膽堿在突觸處的積累，延長并增加乙酰膽堿的可利用性，在臨床可用于阿爾茲海默癥、重癥肌無力及青光眼的治療[2-3]。目前用于治療阿爾茨海默癥的藥物，有四種為乙酰膽堿脂酶抑制劑，如他克林、利斯的明、多奈哌齊和加蘭他敏，一定程度上對臨床癥狀有緩解作用，但也存在選擇性低、毒副作用大等不足[4]。

中藥在治療阿爾茨海默癥及新藥開發方面發揮著重要作用。近年來，很多天然產物被報道具有乙酰膽堿酯酶抑制作用，如石杉堿甲、加蘭他敏、石蒜堿等，在阿爾茨海默癥等疾病的治療中具有巨大的開發潛力[5]。中藥石菖蒲是天南星科植物石菖蒲AcorustatarinowiiSchott干燥根莖，性辛、苦、溫，歸心、胃經，具有開竅豁痰，醒神益智，化濕開胃之功，臨床上用于治療神昏癲癇，健忘失眠，耳鳴耳聾[6-7]。有學者總結中藥治療阿爾茨海默癥的用藥規律，發現傳統用于治療老年癡呆的中藥復方中石菖蒲使用頻率最高[8]。含石菖蒲的傳統方劑開心散、遠志散和益氣聰明湯，具有治好忘，補益心脾、化痰開竅、益智定志的功效，現代研究也表明這些制劑有改善癡呆模型動物的空間學習能力和記憶再現能力[9-11]，與石菖蒲的傳統功效相一致。

高效薄層色譜 (HPTLC) 是一種分離效率高、成本低、樣品用量少、應用廣泛的微量分析技術。薄層色譜-生物自顯影技術(thin-layer chromatography bioautography)是應用薄層層析和生物活性檢定于一體的活性物質篩選方法，該方法操作簡單、耗費低、靈敏度和專屬性強，用于膽堿酯酶抑制劑、抗氧化劑、脂肪酶抑制劑和糖苷酶抑制劑的篩選[12-15]。質譜 (MS) 是一種靈敏度高、選擇性好、可進行定性分析的現代儀器。薄層色譜-質譜技術的聯用，可實現優勢互補，為復雜樣品中目標化學成分的結構鑒定提供一條有效的途徑[16]。分子對接是利用算法預測受體和配體的復合構象及其結合親和力，近年來已被廣泛用于篩選藥物分子和驗證藥物活性[17-18]。本研究以石菖蒲為研究對象，采用薄層色譜-生物自顯影聯合質譜技術篩選和鑒定石菖蒲中抗乙酰膽堿酯酶活性成分，并結合分子對接技術，驗證和評價所篩選成分的活性效能，為石菖蒲防治阿爾茨海默癥等疾病的進一步研究以及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 乙酰膽堿酯酶(AChE，批號1002932438)、固藍B鹽(批號1002072823)(美國Sigma 公司)；乙酸-α-萘酯(上海化成工業發展有限公司，批號A0037)；牛血清白蛋白(BSA，上海藍季科技發展公司，批號110913)；加蘭他敏(中國食品藥品檢定研究院，批號10050-200802)。石菖蒲產地云南昭通(批號2018071501)，經上海中醫藥大學中藥研究所吳立宏研究員鑒定為天南星科植物石菖蒲AcorustatarinowiiSchott干燥根莖。硅膠預制板(煙臺市化學工業研究所，批號20200919)；硅膠GF254預制薄層板(TLC Silica gel 60 F254，德國Merck公司，批號HX01557929)；固相萃取小柱(批號043639275A，美國Waters公司)。甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher Chemical公司)；甲苯、甲醇、乙酸乙酯為分析純(上海國藥集團化學試劑有限公司)；水為超純水。

1.2 儀器 薄層色譜自動點樣儀、薄層色譜成像儀、薄層色譜自動展開儀、雙槽展開缸、薄層色譜質譜接口儀(瑞士CAMAG公司)；超聲波清洗器(美國Branson公司)；SC-15恒溫水浴槽(上海比朗儀器有限公司)；Milli-Q Synthesis A10(美國Millipore公司)；BT25S型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；超高效液相色譜儀-線性離子阱質譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 陽性對照溶液、試劑溶液制備 精密稱取陽性對照藥(加蘭他敏)5 mg，甲醇制成每1 mL含1 mg該成分的陽性對照溶液。取乙酰膽堿酯酶(50 U/mL)1 mL，溶于50 mL Tris-HCl 緩沖液(20 mmol/L，pH 7.8)中，加入50 mg牛血清白蛋白(BSA)[19]，制成酶溶液。精密稱取乙酸-α-萘酯75 mg，置于50 mL量瓶中，50 mL無水乙醇溶解，制成1.5 mg/mL底物溶液。精密稱取固藍B鹽50 mg，置于50 mL量瓶中，蒸餾水溶解并定容，制成1 mg/mL顯色劑溶液。

1.4 樣品溶液制備及揮發油提取 取藥材粉末10 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL甲醇，加熱回流2 h，取1 mL濾液，作為樣品溶液I；其余濾液蒸干，殘渣加2 mL水復溶，轉移至經甲醇活化、水平衡后的固相萃取小柱(SPE-C18，5 g)中，依次用50 mL水、10%甲醇、20%～90%甲醇、甲醇洗脫，共收集11份洗脫液，分別減壓濃縮，殘渣加1 mL洗脫液溶解，濾過，作為樣品溶液Ⅱ～Ⅻ。

按照2020年版《中國藥典》一部揮發油測定法(通則2204乙法)，取藥材粉末10 g，加入300 mL水，置于揮發油測定器中，加入二甲苯1 mL，連接回流冷凝管，加熱保持微沸5 h，停止加熱，放置15 min，取二甲苯層，甲醇稀釋5倍，作為揮發油溶液XⅢ。

1.5 薄層色譜分析 采用自動點樣儀，將樣品溶液I～XⅢ(5.0 μL/條帶)點于高效硅膠預制薄層板上，條帶寬度為8 mm，條帶間距為11.4 mm，置于雙槽展開缸(20 cm×10 cm)中展開，展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲醇(10∶1∶0.2)，展距8.5 cm，平行展開制備3份薄層板，第1塊薄層板用10%硫酸乙醇顯色后，在紫外光燈(365 nm)下檢視；第2塊用生物自顯影法顯色后進行生物活性檢測，第3塊直接用于質譜分析。

1.6 生物自顯影分析 根據文獻[19]報道的方法，并作適當調整。將點樣展開后的薄層板浸入乙酸-α-萘酯溶液，取出，冷風快速吹至薄層板無乙醇味，浸入乙酰膽堿酯酶溶液中，取出，置于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育20 min，取出，浸入固藍B鹽溶液中，取出，觀察白色活性斑點；取陽性對照溶液，同法平行操作，將薄層板置薄層色譜成像儀上檢視、拍照。

1.7 質譜分析 在活性條帶對應的位置上用鉛筆在未顯色薄層板表面作好標記，將標記部位置于TLC-MS接口處，由UHPLC色譜儀直接洗脫并泵入電噴霧線性離子阱質譜(LTQ-ESI-MS)儀進行分析，洗脫劑為水-乙腈混合物(5∶95)；體積流量0.3 mL/min。質譜儀由Xcalibur軟件控制。主要工作參數設定為離子源加熱溫度300 ℃；毛細管溫度350 ℃；噴霧電壓3.5 kV；毛細管電壓10 V；采用全掃描模式，m/z100～1 000；采集時間0.2～0.5 min。

1.8 分子對接 從RCSB蛋白數據庫(RCSB PDB，http://www.rcsb.org/)下載人源乙酰膽堿酯酶(AChE)結構(PDB ID為4EY6)，該蛋白原配體為乙酰膽堿酯酶抑制劑加蘭他敏[20]，選擇A鏈作為受體進行對接，將其導入PyMOL軟件，進行結構優化后保存為pdb格式，再導入Auto Dock Tools 1.5.6[21]優化后保存為pdbqt格式。從有機小分子生物活性數據庫(PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載目標化學成分的3D結構，將其導入Chem 3D 19.0，采用MM2力場進行能量最小化操作后保存為mol 2格式，再導入Auto Dock Tools 1.5.6優化后保存為pdbqt格式。在Auto Dock Tools 1.5.6中運行Auto Grid，以center x=-2.827，center y=-40.098，center z=30.802為中心，構建64×64×64的盒子，采用Auto Dock Vina 1.1.2進行對接，導出結合能最低的構象，Discovery Studio 2016對結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 薄層鑒別 本實驗考察了石油醚、乙酸乙酯、甲醇、75%甲醇，發現甲醇提取率最高，白色活性斑點最清晰，故選擇其作為提取溶劑。以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(10∶1∶0.2)為展開劑時分離度最好，高效默克硅膠預制薄層板的質譜信號最佳。甲醇提取溶液I的薄層圖中有3個活性條帶(Rf分別為0.57、0.45、0.23)，分別作為斑點1、2、3(圖1A)，10%硫酸乙醇顯色，在紫外燈下觀察。甲醇提取物梯度固相萃取后對成分進行分段富集(圖1B、1C)，采用揮發油提取法提取揮發油，尋找活性成分，結果見圖1C。固相萃取共獲得11個洗脫段，活性部位主要集中在50～90%部分(Ⅶ～Ⅺ)，圖1C顯示，在50～60%有活性斑點1，同時發現1個新的活性斑點，記為斑點4；70%段有活性斑點2，同時發現活性斑點5；90%段含有活性斑點3；揮發油中含有活性斑點1、3，未發現新的活性斑點。

注：S為加蘭他敏。A、C分別用10%硫酸乙醇溶液顯色(365 nm)、生物自顯影試劑顯色(可見光)，B為部分分段組分的生物自顯影試劑顯色圖。圖1 石菖蒲提取液薄層色譜-生物自顯影圖譜Fig.1 TLC-bioautographic chromatograms of A. tatarinowii root extract

2.2 質譜分析 圖2、表1顯示。斑點1在ESI+模式下m/z231.08[M+Na]+、209.17[M+H]+，二級質譜m/z216[M+Na-15]+，結合分子質量、與文獻[22]、對照品比對，鑒定為β-細辛醚；斑點2在ESI+模式下m/z277.25[M+Na]+，二級質譜m/z259.25[M+Na]+，文獻中未查到相應成分；斑點3在ESI-模式下m/z279.33[M-H]-、281.33[M+H]+，二級質譜m/z261.33[M-H-H2O]-，結合分子質量及與對照品對比推測為亞油酸[22]；斑點4在ESI+模式下m/z 235.25[M+H]+，二級質譜m/z217.170 8[M+H-H2O]+，結合分子質量及與文獻[23]推測為菖蒲螺酮烯；斑點5在ESI+模式下m/z241.25[M+Na]+、219.33[M+H]+，二級質譜m/z209.08[M+Na-OCH3]+，結合分子質量及與文獻[24]比對推測為桔利酮。

圖2 5個活性斑點質譜圖及其結構Fig.2 MS spectra and structures of five active zones

表1 5個活性斑點MS鑒定結果Tab.1 Results of MS identification of five active zones

2.3 分子對接 結合能≤-1.2 kcal/mol時小分子與蛋白可以自由結合，≤-5.0 kcal/mol時小分子與蛋白相互作用較強，≤-7.0 kcal/mol時視為小分子與蛋白相互作用強烈，結合能越低相互作用越強[25]。表2顯示，β-細辛醚、α-細辛醚、亞油酸、桔利酮、菖蒲螺酮烯與AChE的結合能均小于-5.0 kcal/mol，表明它們與AChE相互作用均較強，驗證生物自顯影實驗結果，親和能力由強到弱依次為菖蒲螺酮烯、桔利酮、α-細辛醚、亞油酸、β細辛醚。

將表2結果導入Discovery Studio 2016軟件進行可視化分析，結果見圖3。由此可知，AChE與各活性成分產生作用的重要氨基酸殘基為TRP86、TYR337、PHE338、TYR124和HIS447，其次為TYR72、GLY121、SER23、TYR341，主要表現為氫鍵作用和疏水作用。

表2 分子對接的結合自由能Tab.2 Binding free energy of molecular docking

圖3 活性成分與AChE受體對接模式圖Fig.3 Docking mode profiles for active constituents and AChE receptor

3 討論

石菖蒲作為一味傳統中藥，具有保護神經元、提高記憶認知功能，在臨床主要用于治療和改善神經系統疾病[26]。文獻對含量較高的β-細辛醚和α-細辛醚乙酰膽堿酯酶抑制活性多有報道，但對石菖蒲中其他成分研究較少，可能是因為其他成分含量較低，對分離、篩選及相關分析形成一定難度。本文通過高效薄層色譜-生物自顯影法對石菖蒲中乙酰膽堿酯酶抑制成分進行了系統篩選，發現甲醇提取物通過SPE固相萃取小柱后的50%～90%甲醇洗脫段富含活性成分，進一步展開分析發現包括β-細辛醚在內的5個活性斑點，通過質譜的一級和二級碎片分析，結合文獻數據，其中4個活性斑點經鑒定可能為β-細辛醚(與α-細辛醚重合)、亞油酸、桔利酮和菖蒲螺酮烯，并用β-細辛醚、α-細辛醚和亞油酸對照品驗證了鑒定結果；另一個m/z277.25[M+Na]+的活性斑點，未獲得鑒定。將5個鑒定的活性成分分子結構與AChE蛋白進行分子對接，以結合能低于-5.0 kcal/mol為標準進行驗證，結果發現，5個活性成分均與AChE受體有較好的結合性，可能主要是通過TRP86、TRP337和PHE338等氨基酸與乙酰膽堿酯酶產生氫鍵作用或疏水作用。

β-細辛醚和α-細辛醚是石菖蒲揮發油中的主要成分，有文獻報道細辛醚類是石菖蒲益智作用的藥效物質，并認為其作用機理可能是小分子能夠順利通過血腦屏障進入大腦，抑制腦內乙酰膽堿酯酶活力、誘導c-jun基因表達等改善學習記憶功能[27-28]；另有研究顯示體內長鏈不飽和脂肪酸的缺少與AD發病有密切關系，長期適量服用長鏈不飽和脂肪酸亞油酸具有預防AD的作用，亞油酸具有乙酰膽堿酯酶活性(IC50值為18.17±1.86 mg/mL)[29-30]。β-細辛醚和α-細辛醚雖然含量高，且具有乙酰膽堿酯酶抑制活性，但有報道具有急性毒性和致突變作用[31]，從而限制了臨床應用，本次研究發現石菖蒲中菖蒲螺酮烯和桔利酮結構與乙酰膽堿酯酶的結合能明顯低于β-細辛醚和α-細辛醚，具有顯著的乙酰膽堿酯酶抑制作用，尚未見相關文獻報道，值得深入研究，對石菖蒲安全有效的臨床應用和新藥開發具有重要意義。