一測多評法同時測定不同采收期白苞蒿中8種成分

何 兵，田 吉，楊世艷

(1.西南醫(yī)科大學藥學院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

白苞蒿ArtemisialactifloraWall.為菊科蒿屬多年生草本植物，又名白花蒿，主要分布于我國秦嶺以南各省區(qū)[1]，常見于山坡、路旁、林緣，是中藥劉寄奴的基原植物之一[2]，以全草入藥，性甘、微苦，平，具有清熱、解毒、止咳等功效，主要用于治療慢性肝炎、肝硬化、腎炎等癥[3]，主要成分為有機酸類和黃酮類[4-6]。其中有機酸具有較強的抗菌、抗炎、抗氧化等生物活性[7]，而黃酮抗病毒、抗氧化、清除自由基等活性較強[8]。關于白苞蒿成分的含量測定較少，僅有1篇報道涉及槲皮素[9]。為了進一步完善和提高白苞蒿質量標準，本實驗采用一測多評法同時測定該藥材中富馬酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷的的含量。

1 材料

1.1 儀器 P680高效液相色譜儀(美國戴安公司)；LC2030高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS105DU型電子天平(瑞士Mettler -Toledo公司)；AS7240A型超聲波清洗器(240 W，40 kHz，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Direct-Q3型超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)。Lubex Kromasil C18、AkzoNobel Kromasil C18、Dikma Inspire C18、Dikma Plastil C18、Dikma Diamonsil(2) C18、Dikma Silversil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 試劑與藥物 富馬酸(批號F016-120615，純度98.58%)、綠原酸(批號A0022-19030620，純度99.39%)、隱綠原酸(批號A0024-19032403，純度99.07%)、紫槲皮苷(批號A0103-19010210，純度99.47%)、異牡荊苷(批號A0681-19051405，純度99.02%)、異槲皮苷(批號A0439-19051005，純度99.74%)、異綠原酸A(批號A0025-19032601，純度99.82%)、異綠原酸C(批號A0027-19031603，純度99.65%)對照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司。白苞蒿于2019年4、6、8、10、12月采自四川瀘州龍馬潭區(qū)，經西南醫(yī)科大學藥學院何兵副研究員鑒定為菊科蒿屬植物白苞蒿ArtemisiaLactfloraWall.，60 ℃烘干，粉碎，過3號篩。乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Lubex Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～30 min，5%～30%A；30～31 min，30%～5%A；31～35 min，5%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長0～11 min，209 nm(富馬酸)，11～35 min，326 nm(綠原酸、隱綠原酸、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷、異綠原酸A、異綠原酸C)；進樣量10 μL，色譜圖見圖1。由此可知，在該條件下各成分分離度良好。

1.富馬酸 2.綠原酸 3.隱綠原酸 4.紫槲皮苷 5.異牡荊苷 6.異槲皮苷 7.異綠原酸A 8.異綠原酸C1.fumaric acid 2.chlorogenic acid 3.cryptochlorogenic acid 4.rutin 5.isovitexin 6.isoquercitrin 7.isochlorogenic acid A 8.isochlorogenic acid C圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，加75%甲醇制成分別含富馬酸2.095 mg/mL、綠原酸5.953 mg/mL、隱綠原酸0.461 mg/mL、紫槲皮苷3.490 mg/mL、異牡荊苷2.126 mg/mL、異槲皮苷0.492 mg/mL、異綠原酸A 3.387 mg/mL、異綠原酸C 2.432 mg/mL的貯備液，分別吸取0.5 mL，置于10 mL量瓶中，75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為0.105、0.298、0.023、0.175、0.106、0.025、0.169、0.122 mg/mL的溶液，即得避光低溫保存。

2.2.2 供試品溶液 取藥材粉末(過3號篩)約1.0 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加25 mL 75%甲醇，超聲處理45 min，取出，放冷至室溫，75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下貯備液0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL，置于 10 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，在“2.1”項下色譜條件進樣測定。以峰面積為縱坐標(Y)，各成分質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，另取“2.2.1”項下對照品溶液，75%甲醇逐級稀釋，分別以信噪比3∶1、10∶1為檢測限、定量限，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得富馬酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.31%、0.25%、0.79%、0.55%、0.63%、0.74%、0.52%、0.60%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，室溫放置，于0、4、8、12、24、48 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得富馬酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.81%、0.63%、1.06%、0.95%、1.02%、1.70%、1.17%、1.56%，表明溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.3.4 重復性試驗 取采于8月的藥材適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得富馬酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷含量RSD分別為1.12%、0.93%、1.49%、0.99%、1.08%、1.57%、1.22%、1.55%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的藥材9份，每份0.5 g，將其分成3組，每組3份，精密加入含富馬酸1.625 mg/mL、綠原酸4.253 mg/mL、隱綠原酸0.205 mg/mL、紫槲皮苷1.735 mg/mL、異牡荊苷1.416 mg/mL、異槲皮苷0.238 mg/mL、異綠原酸A 2.469 mg/mL、異綠原酸C 1.647 mg/mL的對照品溶液0.50、0.75、1.00 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，富馬酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷平均加樣回收率分別為98.46%、98.22%、97.25%、97.78%、97.90%、97.34%、98.15%、98.03%，RSD分別為1.03%、1.13%、1.79%、1.65%、1.52%、1.85%、1.25%、1.40%。

2.4 相對校正因子計算

2.4.1 斜率校正法 參考文獻[10]報道，根據標準曲線公式A=a·C+b，C=(A-b)/a=A/a-b/a，當a/b>100時b/a可忽略不計，即C=A/a，則相對校正因子fi/s可直接以斜率之比計，即fi/s=ai/as。待測成分i濃度為Ci=Ai/ai=Ai/(as·fi/s)，其中as為內標標準曲線斜率，ai為待測成分標準曲線斜率，結果見表2。

2.4.2 多點校正法 參考文獻[11]報道，校正因子fi/s計算公式為fi/s=fi/fs=(Ai/Ci)/(As/Cs)，待測成分i濃度為Ci=Ai/[fi/s×(As/Cs)]，其中Ai和Ci分別為待測成分峰面積、濃度，As、Cs分別為內標峰面積和濃度，結果見表2。

表2 各成分相對校正因子(內標綠原酸)Tab.2 Relative correlation factors for various constituents (with chlorogenic acid as an internal standard)

2.4.2 不同儀器和色譜柱考察 考察不同實驗室、色譜儀(Dionex P680、Shimadzu LC2030)、色譜柱(Lubex Kromasil C18、AkzoNobel Kromasil C18、Dikma Inspire C18、Dikma Plastil C18，均為250 mm×4.6 mm，5 μm)對相對校正因子的影響，結果見表3，可知不同儀器和不同色譜柱對相對校正因子無明顯影響(RSD<3%)。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relutive corection factors

2.5 色譜峰定位 采用相對保留時間[12-15]對色譜峰進行定位，結果見表4。雖然該方法對保留時間靠前的色譜峰定位較準確，但隨著保留時間延長，其預測值與實測值之間的相對誤差越來越大，有些甚至超過±6%，并且兩者往往相差近2 min，此時很難準確定位。

王龍星等[16]發(fā)現(xiàn)，在相同色譜條件下即使采用不同儀器和色譜柱，各成分保留時間之間也存在線性關系，根據此原理，以Dionex Lubex Kromasil所得保留時間為橫坐標(X)，其他儀器、色譜柱所得保留時間為縱坐標(Y)進行回歸，測得其R2分別為0.999 0、0.999 3、0.999 8、0.999 3、0.999 3、0.999 9、0.999 4、0.999 4、0.999 7，表明所有數(shù)據點幾乎都落在標準曲線上，即不論采用2個數(shù)據點還是8個，所得校正曲線基本重合，其結果也相差不大。由于本實驗采用一測多評法時其他色譜峰未定位確認，故無法采用多個數(shù)據點繪制校正曲線，故在色譜圖中前后各取一點，如以內標綠原酸與另1種常見、易辨認、對照品易獲取的紫槲皮苷進行兩點校正，同法繪制校正曲線，再以Dionex Lubex Kromasil所得標準保留時間代入校正方程，即可計算各成分預測出峰時間，從而實現(xiàn)快速指認定位，結果見表5。

采用兩點校正時即使采用不同儀器、色譜柱，隨著保留時間延長預測值與實測值之間的相對誤差仍很低，即預測值與實際值非常接近，可實現(xiàn)精準定位，但其唯一不足是保留時間靠前的色譜峰(特別是10 min以內者)在未納入兩點校正其預測實測保留時間之間相對誤差較高，故可利用表4相對保留時間來預測[17]，即兩點校正適合保留時間靠后的色譜峰，而相對保留時間校正適合保留時間靠前者，兩者結合，所有峰均可獲得準確的預測值。若該色譜峰附近還有其他色譜峰干擾定位，則可再根據各成分紫外吸收光譜、整體峰形、峰面積占比進一步準確定位。

表4 相對保留時間定位色譜峰Tab.4 Location of chromatographic peaks by relative retention time

2.6 樣品含量測定 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，分別采用外標法、標準曲線法、一測多評法(斜率校正、多點校正、單點校正)計算含量，結果見表6。由此可知，各方法所得結果之間的RSD<2%；3種校正手段所得結果與外標法之間的相對誤差絕對值<2%，通過t檢驗可知其差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同采收期藥材所含成分含量不同，在10月最高。另外，采用單點校正一測多評法時，各成分含量測定結果與外標法一致。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器在200～380 nm掃描白苞蒿中各成分的紫外吸收，實驗發(fā)現(xiàn)富馬酸在209 nm有最大吸收，綠原酸類在326 nm左右有最大吸收，而紫槲皮苷、異槲皮苷類黃酮在256、355 nm左右有最大吸收，異牡荊苷在271、338 nm有最大吸收。異牡荊苷在326、338 nm檢測，峰高差異不大，顧異牡荊苷可采用326 nm檢測。由于紫槲皮苷和異牡荊苷峰挨得很近，無法切換波長，顧紫槲皮苷仍以326 nm檢測，同時異槲皮苷再換波長也無意義。為避免過多的切換波長，除富馬酸采用209 nm外，其余成分均以326 nm檢測。

3.2 單點校正的優(yōu)勢 校正因子的準確計算直接影響一測多評的準確性，它是一測多評推廣應用的關鍵。校正因子的計算常用的是多點校正[18-21]和斜率校正[22-23]。不論是多點校正還是斜率校正，與外標法或標準曲線法結果相近但不一致。而單點校正是從多點校正和斜率校正演變而來，直接以外標法濃度點的單點斜率之比作為校正因子，計算更為快捷，其結果與外標法完全一致。單點校正完全等同于外標法，外標法適用的地方，單點校正即適用，否認單點校正也就是否認外標法。

3.3 不同定位方法的優(yōu)缺點 一測多評推廣應用的另一關鍵在于色譜峰的準確定位，定位不準就會出現(xiàn)所測成分非待測成分。本文詳述了兩點校正法用于定位色譜峰的方法，其特別適用于保留時間靠后的色譜峰定位，其相對誤差普遍小于1.2%。兩點校正法唯一的缺陷在于當保留時間太過靠前的色譜峰在未納入校正方程時，其相對誤差較大，從而導致定位不準。但保留時間靠前的色譜峰剛好是相對保留時間定位的優(yōu)勢。故一測多評的定位若結合相對保留時間和兩點校正法，以相對保留時間定位10 min以內的色譜峰，以兩點校正定位10 min以后的色譜峰，二者結合所有待測成分色譜峰均可實現(xiàn)精準定位(相對誤差<2%)，其特別適合相鄰色譜峰眾多、峰高批間差異較大、色譜峰紫外吸收相近或儀器無法檢測紫外吸收的色譜峰定位。

表5 兩點校正定位色譜峰Tab.5 Location of chromatographic peaks by two-point correction

表6 各成分含量測定結果(mg/g，n=3)Tab.6 Results of content determination of various constituents (mg/g，n=3)

3.4 一測多評在白苞蒿質控中的優(yōu)勢 白苞蒿生態(tài)適應性較強，分布較為廣泛，具有較高的藥用價值。在《全國中草藥匯編》、《中藥大辭典》、《中華本草》等均有收載。目前白苞蒿未收載入《中國藥典》一部，但在2020年版《中國藥典》中，白苞蒿為中藥劉寄奴的基原植物之一[2]，白苞蒿有著優(yōu)良的應用開發(fā)潛力。本研究采用HPLC-QAMS同時測定了不同采收期白苞蒿所含的8種主要活性成分的含量。為進一步完善和提高白苞蒿的質量標準提供科學依據，該法具有一定的推廣應用價值。