不同規格羌活微型飲片質量評價

廉 婧，張 超，華 悅，任天航，程世贊，蘇國明，史 輯,2*，賈天柱,2

(1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥炮制技術產業創新中心，遼寧 大連 116600)

中藥飲片是中藥行業的三大支柱之一，是湯劑和中成藥的主要原料，其質量優劣直接影響到臨床用藥的安全性與有效性。就飲片而言，同種中藥材的產地與加工的差異、來源的不確定性和不穩定性導致中藥飲片的外觀形態差異大，中藥飲片的批間、批內質量不均一。另外因各省炮制規范和用藥習慣不同，各地飲片形制也常有差異，中國藥典的炮制通則在切制項下，僅規定了片、塊、絲、段的厚度[1]，而對片形大小并未規定。因而，藥材的大小尺寸、質地就成了影響飲片片形大小的主因，加上飲片的商業等級以大為優的習俗，造成飲片片形大塊、大片盛行，人為增加了飲片加工和調劑的困難，直接影響臨床用藥療效的穩定，更導致臨床科研數據重復性、可靠性不足，也制約了中藥飲片工業化生產的自動化、智能化進程。因此，迫切需要一種易于鑒定和檢測，可經標準化工藝制備、規模化生產、質量均一、可實現自動化分揀，提高臨床用藥精準性的新型飲片作為傳統中藥飲片的補充，以彌補其不足。

2015年，賈天柱教授[3]提出了微型飲片[2]的概念。微型飲片是指邊長在0.5～1.0 cm左右的小薄片，具有高品質、高流動、高煎出的特性，可適應飲片的智能生產、智能調劑和智能煎制，提高其生產效率和利用率。微型飲片以飲片的形制變革為外在形式，使飲片長寬變小，片子變薄，片片均勻[4]，具有“規格劃一，流動可調”特點的，且可滿足中醫臨床辨證施治需要的微型飲片具有重要意義。

羌活為傘形科植物羌活NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang或寬葉羌活NotopterygiumfranchetiiH.de Boiss.的干燥根莖和根，羌活的NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang根莖較長，藥材以根莖為主，油性足，氣清香，寬葉羌活NotopterygiumfranchetiiH.de Boiss.的根莖較短，藥材以根為主，油性差，氣弱，有膳濁氣，都具有解表散寒、祛風除濕、止痛的功效，常用于風寒感冒，頭痛項強，風濕痹痛，肩背酸痛等癥[5]，主產于四川、甘肅、青海等地[6]。羌活主要含揮發油及萜類、香豆素類、糖及糖苷類、有機酸及酚類、多炔類等成分[7-8]，具有抗炎、抗氧化、抗心律失常、抗菌、抗癌細胞增殖等作用[9]。

以羌活為例，對不同形制規格的羌活飲片的干膏率，浸出物，有效成分含量等進行測定，采用HPLC法建立指紋圖譜，并進行相似度評價、聚類分析、多元統計分析以及多維化學分析，旨在為不同規格及產地的羌活微型飲片質量控制提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 E2695-2998型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)；AE240型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑與藥物 對照品綠原酸(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-13031401，純度>98%)，阿魏酸(四川省維克奇生物科技有限公司，批號wkq19030705，純度>98%)，鐮葉芹二醇(批號B50624)、羌活醇(批號B20966)，阿魏酸苯乙醇(批號B27087)，紫花前胡苷(批號B21685)，異歐前胡素(批號B21546)(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%)。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。羌活共36批，采自甘肅禮縣、青海西寧、四川理縣，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為傘形科植物羌活NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang或寬葉羌活NotopterygiumfranchetiiH.de Boiss.的干燥根莖和根。

2 方法

2.1 微型飲片切制 采用切片刀(刀刃長度175 mm,寬度為45 mm)，刀刃角度大于65°，將3個產地藥材切制成不同規格微型飲片，編號S1～S36，以甘肅禮縣為例，見圖1，具體信息見表1。

圖1 羌活微型飲片(甘肅禮縣)Fig.1 Fine slices of Notopterygii Rhizoma et Radix(Lixian County,Gansu)

表1 羌活微型飲片信息Tab.1 Information for fine slices of Notopterygii Rhizoma et Radix

2.2 含量測定

2.2.1 揮發油 取微型飲片粉末(過2號篩)約70.00 g(相當于含揮發油0.5～1.0 mL)，精密稱定，置于1 000 mL燒瓶中，加500 mL水與數粒碎瓷片，振搖混合后連接揮發油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發油測定器的刻度部分至溢流入燒瓶，置于電熱套中緩緩加熱至沸，保持微沸約5 h，至測定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達零刻度線上面5 mm處，靜置3 h，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與零刻度線平齊，讀取揮發油量，并計算其含量。

2.2.2 異歐前胡素、羌活醇

2.2.2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)(44∶56)；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長310 nm；進樣量10 μL。

2.2.2.2 供試品溶液制備 取微型飲片粉末(過三號篩)約0.400 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2.3 對照品溶液制備 精密稱取羌活醇、異歐前胡素對照品適量，甲醇制成質量濃度分別為0.060、0.030 g/L溶液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取微型飲片(S1)6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定，測定各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD。

2.3.2 穩定性試驗 取微型飲片(S1)6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定，測定各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD。

2.3.3 重復性試驗 取微型飲片(S1)6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定，測定各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD。

2.3.4 加樣回收率試驗 取微型飲片(S17)6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按1∶1比例加入對照品，在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定，計算平均加樣回收率和RSD。

2.4 干膏率測定 精密稱取微型飲片5 g，加10倍量冷水浸泡40 min，直火加熱，水沸后改用文火煎煮30 min，濾過，藥渣加8倍量水繼續煎煮，水沸后改用文火煎煮20 min，濾過，合并2次藥液，定容至100 mL量瓶中，混勻，精密量取煎液50 mL，置于恒重蒸發皿中，沸水浴濃縮至干，置于105 ℃烘干箱中烘至恒重，記錄煎膏質量，計算出膏率。

2.5 浸出物含量測定 取微型飲片約4 g，精密稱定，置于250 mL錐形瓶中，精密加入乙醇100 mL，密塞，稱定質量，靜置1 h，連接回流冷凝管，加熱至沸騰并保持微沸1 h，放冷，取下錐形瓶，密塞，加水補足減失的質量，搖勻，干燥濾器過濾，精密量取濾液25 mL，置于干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，在105 ℃下干燥3 h，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量。以干燥品為標準，計算浸出物含量。

2.6 HPLC指紋圖譜建立

2.6.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.3%乙酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，15%～26%A，10～20 min，26%～28%A，20～30 min，28%～35% A，30～60 min，35%～85%A，60～70 min，85%A)，體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長325 nm；進樣量10 μL。

2.6.2 供試品溶液制備 取微型飲片粉末(過三號篩)約0.4 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.6.3 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、紫花前胡苷、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素對照品適量，甲醇制成質量濃度分別為 0.296、0.433、0.373、0.500、0.412 g/L的溶液，即得。

2.7 化學計量學研究 以36批樣品HPLC指紋圖譜共有峰峰面積為變量，采用SPSS 25.0軟件進行聚類分析，SIMCA-P 13.0軟件進行主成分分析、偏最小二乘判別分析。再采用層次分析法，采用Yaahp 10.3軟件將綜合評價設為決策目標，將干膏率及浸出物、異歐前胡素、羌活醇含量設為方案層，分別給予權重系數，建立判斷矩陣，加權綜合評分。

3 結果

3.1 各成分含量

3.1.1 揮發油 3個產地樣品揮發油得率分別為四川理縣2.14%、甘肅禮縣1.71%、青海西寧1.43%，均符合2020年版《中國藥典》規定的羌活揮發油質量分數不低于1.4%的要求。

3.1.2 羌活醇、異歐前胡素 將2種成分對照品溶液稀釋成系列質量濃度，在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標(Y)，各成分質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，結果見表2，可知均在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships for various constituents

在精密度試驗中，各共有峰相對保留時間RSD<0.08%，相對峰面積RSD<0.49%，表明儀器精密度良好。在穩定性試驗(24 h)中，各共有峰相對保留時間RSD<1.50%，相對峰面積RSD<0.64%，表明溶液在24 h內穩定性良好。在重復性試驗中，各共有峰相對保留時間RSD<3.00%，相對峰面積RSD<3.00%，表明該方法重復性良好。加樣回收率試驗結果見表3。

表4顯示，不同產地藥材中各成分含量差異較大，其中產地甘肅禮縣的S12樣品中羌活醇、異歐前胡素總含量較高，達到2020年版《中國藥典》規定的3.43倍；產地青海西寧的S17樣品中兩者總含量最高，為藥典規定的3.52倍；但產地四川理縣僅S32樣品中兩者總含量符合藥典規定。

表3 各成分加樣回收率試驗結果(n=6)Tab.3 Results of recovery rates for various constituents (n=6)

表4 各成分含量測定結果Tab.4 Results of content determination of various constituents

3.2 干膏率 見表5。

表5 出膏率測定結果Tab.5 Results for determination of dry extract rate

3.3 浸出物含量 見表6。

表6 浸出物含量測定結果Tab.6 Results of content determination of leachate

圖2 36批樣品HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints for thirty-six batches of samples

5.綠原酸 10.紫花前胡苷 11.阿魏酸 15.羌活醇 16.阿魏酸苯乙醇酯 17.異歐前胡素5.chlorogenic acid 10.nodakenin 11.ferulic acid 15.notopterol 16.β-phenethyl ferulate 17.isoimperatorin圖3 對照圖譜Fig.3 Reference chromatogram

3.4 HPLC指紋圖譜 36批樣品按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項色譜條件下進樣測定，將圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”，以S1為參照，設定時間窗寬度為0.1 s，指紋圖譜、對照圖譜分別見圖2～3，共標定18個共有峰。通過與對照品比對，指認其中6種成分，分別為5號峰綠原酸、10號峰紫花前胡苷、11號峰阿魏酸、15號峰羌活醇、16號峰阿魏酸苯乙醇酯、17號峰異歐前胡素。由于10號峰分離度較好，峰面積大而穩定，故以其為參照(S)，測得各共有峰相對保留時間RSD為0.38%～2.37%，相對峰面積RSD為38.36%～236.98%，表明不同產地、規格樣品中各成分含量差異較大，相似度見表7。由此可知，各批樣品所含成分種類整體上隨產地變化較大，其中四川理縣產者差異較大。

表7 36批樣品相似度Tab.7 Similarities of thirty-six batches of samples

3.5 聚類分析 以36批樣品HPLC指紋圖譜共有峰峰面積為變量，采用SPSS 25.0軟件進行聚類分析，結果見圖4。由此可知，當判別距離為25時，各批樣品聚為2類，產地四川理縣(S25～S36)第1類，產地甘肅禮縣(S1～S12)、青海西寧(S13～S24)為第2類。

3.6 主成分分析 以36批樣品HPLC指紋圖譜共有峰峰面積為變量，采用SIMCA-P 13.0軟件進行主成分分析[10-14]，特征值、方差貢獻率見表8，碎石圖見圖5，初始因子荷載矩陣見表9。

圖4 36批樣品聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis plot for thirty-six batches of samples

表8 主成分特征值和方差貢獻率Tab.8 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

圖5 主成分分析碎石圖Fig.5 Scree plot for principal component analysis

表9 主成分初始因子載荷矩陣Tab.9 Loading matrices for initial factors of principal components

以R2X=0.807、Q2=0.168為標準繪制得分圖，見圖6。由此可知，產地甘肅禮縣(S1～S12)樣品分布于得分圖右側并較為集中，青海西寧(S12～S24)樣品分布于得分圖中央，四川理縣(S25～S36)樣品分布于得分圖左側，與聚類分析結果基本一致。

圖6 主成分分析得分圖Fig.6 Score plot for principal component analysis

3.7 偏最小二乘判別分析 采用 SIMCA-P 13.0軟件對36批樣品進行兩兩比較，得分散點圖見圖7，可知產地甘肅禮縣(S1～S12)與青海西寧(S13～S24)樣品各為一類，甘肅禮縣(S1～S12)與四川理縣(S25～S36)樣品各為一類，青海西寧(S13～S24)與四川理縣樣品(S25～S36)各為一類。8個質量差異標志性成分(VIP>1)的VIP圖見圖8，其中8號峰不明(VIP=1.378 51)，10號峰為紫花前胡苷(VIP=1.337 45)，13號峰不明(VIP=1.284 45)，18號峰不明(VIP=1.212 24)，17號峰為異歐前胡素(VIP=1.193 17)，1號峰不明(VIP=1.189 15)，12號峰不明(VIP=1.121 13)，15號峰為羌活醇(VIP=1.064 27)。

圖7 偏最小二乘判別分析得分圖Fig.7 Score plots for partial least squares discriminant analysis

圖8 偏最小二乘判別分析VIP圖Fig.8 VIP diagram for partial least squares discriminant analysis

3.8 綜合評價 采用Yaahp 10.3軟件，以干膏率及浸出物、異歐前胡素、羌活醇含量為指標，構建層次分析法綜合評判體系進行AHP量化評價，一致性比率CR=0.051 6<0.100，滿足一致性要求，結果見表10。由此可知，異歐前胡素、羌活醇含量占比79.57%，浸出物含量占比7.89%，干膏率占比12.53%，即微型飲片質量主要由有效成分含量決定，其次是干膏率，最后是浸出物含量。

4 討論

含量測定中對色譜條件進行優化，比較不同流動相(乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.3%乙酸)及不同的檢測波長(246、310、325 nm)，柱溫(25、30、40 ℃)的影響，結果表明采用Agilent TC-C18柱，流動相為乙腈-0.3%磷酸，檢測波長為325 nm，柱溫為25 ℃時，各色譜峰的峰形較好，基本達到基線分離。

本研究采用 HPLC 法建立了 36批羌活微型飲片的指紋圖譜，標定了18個共有峰，指認其中6種成分。除產地四川的微型飲片編號為S24，其余

表10 36批樣品綜合得分Tab.10 Comprehensive scores for thirty-six batches of samples

樣品的相似度均>0.900，表明樣品中的化學成分具有較好的一致性。聚類分析結果可知36批羌活微型飲片可分為2大類，四川產羌活為一類，甘肅青海產羌活為另一類。主成分分析結果與聚類分析結果一致。

含量測定結果顯示，甘肅產羌活不同形制規格以S12最佳，青海產羌活不同形制規格微型飲片以S17最佳，四川產羌活不同形制規格以S32最佳。不同形制規格羌活微型飲片的干膏率及浸出物的含量顯著高于常規飲片。總體來看，甘肅產羌活飲片質量較好，不同形制規格微型飲片中，長、寬均為0.5 cm的規格要優于長、寬均為1.0 cm的，長、寬均為0.8 cm規格的次之，長、寬均為1.2 cm的規格飲片含量最低。不同形制規格微型飲片的厚度為0.3 cm規格的質量最佳，其次為厚度0.2 cm規格的，厚度為0.4 cm規格的質量最差。甘肅產羌活以S12規格最優，青海產羌活以S17規格最優，四川產羌活的最優規格是S32，其中S17與S32厚度均為0.3 cm。綜上羌活微型飲片的最優規格為0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm。

不同形制規格羌活飲片的質量要優于傳統飲片，粒徑越小越有利于有效成分的溶出，但是粒徑過小會導致飲片的完整率降低。考慮到飲片廠的大工業生產的實際情況，長、寬均為0.5 cm的規格較好；對于飲片的切制厚度上，通過從丁到薄片的比較，薄片的干膏率優于丁。微型飲片以飲片的形制變革為外在形式，使飲片長寬變小，片子變薄，片片均勻，結合現代中藥質量控制、工業自動化、信息化等技術，將切實解決常規飲片到現代新型飲片的過渡問題，實現用藥各環節的規范化標準化，提高臨床用藥的準確性，并可推動中藥產業鏈從粗放型向集約型、從低效能向高效益快速轉變。