二氫楊梅素硒化修飾及其理化性質(zhì)研究

毛 敏，李香香，楊晶瑩，楊 薇，張 馳，劉信平*

(1.湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

二氫楊梅素是藤茶中主要活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤等多種功效，但由于水溶性、穩(wěn)定性及活性利用率較低等因素導(dǎo)致其廣泛應(yīng)用受到抑制[1-2]。為了解決上述問題，對二氫楊梅素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、衍生化成為目前研究熱點(diǎn)[3]，如將該成分制成金屬螯合物后，其抗菌、抗氧化能力均得到提高[4]。

硒是維持人和動物機(jī)能的必需微量元素之一，具有抗氧化、抗癌等作用，人體長期嚴(yán)重缺硒可導(dǎo)致大骨節(jié)病及克山病[5]，并且有機(jī)硒化物能有效避免無機(jī)硒易引起中毒的缺點(diǎn)，備受醫(yī)藥、食品保健等領(lǐng)域研究人員的關(guān)注。湯震[6]等合成的硒化低聚氨基多糖具有良好的穩(wěn)定性和生物活性；田崇梅[7]等將土茯苓總黃酮和Na2SeO3聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)它有良好的抗氧化活性；高珍珍[8]等報(bào)道，硒化多糖的抗氧化活性明顯高于硒化劑Na2SeO3。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以天然藤茶中提取純化的二氫楊梅素為前體，Na2SeO3為硒化劑制備硒化二氫楊梅素，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行初步研究，以期為拓展該成分及其有機(jī)硒化物的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 二氫楊梅素對照品(陜西博耐澤生物科技有限公司,純度98%)。水中硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(中國計(jì)量科學(xué)研究院)。磷酸鹽緩沖液(自制,pH 6.6)。DPPH(如吉生物科技有限公司)；無水碳酸鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵均為分析純；亞硒酸鈉、乙酸、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、水楊酸、30% H2O2、鹽酸及乙醇均為分析純或優(yōu)級純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為二次蒸餾水和超純水。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；真空干燥箱(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；微波消解儀(美國CEM公司)；雙道原子熒光光度計(jì)(北京海光儀器有限公司)；紫外可見光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；紅外光譜分析儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；綜合熱分析儀 (美國PerkinElmer公司)；MAXimaXRD-7000型X射線衍射儀(日本島津公司)。

2 方法

2.1 單因素試驗(yàn) 按比例稱取二氫楊梅素、亞硒酸鈉，飽和Na2CO3溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH，加熱回流，反應(yīng)后用HCl調(diào)pH，離心，依次用沸蒸餾水、冰蒸餾水淋洗，真空干燥，即得黃棕色粉末狀固體[9-11]。因素水平分別為物料比1∶0.25、1∶ 0.5、1∶ 1、1∶ 2、1∶ 3，反應(yīng)時間40、60、80、100、120 min，反應(yīng)溫度15、35、55、75、95 ℃，反應(yīng)體系pH 8、7、2。

2.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇物料比1∶ 0.25、1∶ 0.5、1∶ 1、1∶ 2，反應(yīng)時間60、80、100、120 min，反應(yīng)溫度35、55、75、95 ℃，反應(yīng)體系pH 2、7、8、9作為影響因素，硒源利用率[(硒化二氫楊梅素中硒質(zhì)量/投入硒質(zhì)量)×100%]作為評價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)優(yōu)化硒化工藝。

2.3 表征

2.3.1 紫外 配制樣品溶液，于200～500 nm區(qū)間掃描其紫外光譜。

2.3.2 紅外 取少量樣品，在4 000～450 cm-1區(qū)間采集其紅外光譜。

2.3.3 綜合熱分析儀(TG) 在Ar氣氛中，取適量樣品至陶瓷坩鍋中檢測。

2.3.4 X射線衍射儀(XRD) 取適量樣品至樣品盤中，在掃描速度8 °/min下采集2 °～80 °(2θ)的數(shù)據(jù)。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取15 mL樣品溶液至小試管中，依次改變受熱溫度、pH及加熱時間，于250～500 nm區(qū)間測定紫外光譜，其中受熱溫度為10、35、55、75、95、100 ℃，pH為2、4、6、7、8、10、12[12]，加熱時間為10、20、30、40、50、60 min。

2.5 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 還原力 取適量小試管，依次加入1 mL 樣品溶液、2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴保溫20 min，迅速冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液，加0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液后在700 nm波長處測定吸光度。

2.5.2 對·OH自由基的清除作用 取適量小試管，依次加入2 mL樣品溶液、2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液、2 mL 6 mmol/L H2O2，37 ℃水浴保溫30 min后于510 nm波長處測定吸光度，計(jì)算·OH自由基清除率，公式為清除率={[A0-(AS-AB)]/A0}×100%，其中A0為用蒸餾水代替樣品溶液的吸光度，AS為樣品溶液吸光度，AB為用蒸餾水代替水楊酸乙醇溶液的吸光度。

2.5.3 對DPPH自由基的清除作用 取適量小試管，依次加入1 mL樣品溶液、2 mL 140 μg/mL DPPH乙醇溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度，計(jì)算DPPH自由基清除率[13]，公式為清除率={[A0-(AS-AB)]/A0}×100%，其中A0為用蒸餾水代替樣品溶液的吸光度，AS為樣品溶液吸光度，AB為用無水乙醇代替DPPH乙醇溶液的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn) 由圖1A可知，硒源利用率隨著物料比增加而升高，在1∶3時達(dá)1.50%；由圖1B可知，反應(yīng)時間對硒源利用率的影響呈“U”型趨勢，即在40、120 min時較高；由圖1C可知，硒源利用率隨著反應(yīng)溫度增加而升高，在95 ℃時達(dá)29.38%；由圖1D可知，反應(yīng)體系pH為中性偏堿性時，有利于提高硒源利用率。

3.2 正交試驗(yàn) 結(jié)果見表1，方差統(tǒng)計(jì)見表2，Duncan多重比較見表3。由表2可知，各因素對硒源利用率均有顯著影響(P<0.01)。由表3可知，物料比1∶ 0.25可節(jié)約原料的用量；反應(yīng)時間120 min有利于提高硒源利用率；反應(yīng)溫度75、95 ℃時硒源利用率較高，并且兩者差異不顯著，同時硒源利用率隨著其增加而升高，故選擇95 ℃；反應(yīng)pH 7、8、9時硒源利用率較高，并且差異不顯著，故進(jìn)行折中后選擇8。綜上所述，最優(yōu)工藝為A1B4C4D3，即物料比1∶ 0.25，反應(yīng)時間120 min，反應(yīng)溫度95 ℃，反應(yīng)pH 8。再進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得硒源利用率為0.807 3，高于正交試驗(yàn)中的最高值(0.736 4)。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 方差分析

表3 Duncan多重比較

3.3 紫外 有研究報(bào)道，二氫楊梅素在207、289 nm波長處分別為類黃酮、黃酮醇的特征峰[14]。結(jié)果顯示，硒化二氫楊梅素類黃酮結(jié)構(gòu)特征峰(208.5 nm)存在，即硒化后黃酮基本母核仍保留；黃酮醇結(jié)構(gòu)特征峰(358.5 nm)存在一定紅移，這是因?yàn)镾e取代二氫楊梅素羥基上的H，絡(luò)合軌道間的電荷轉(zhuǎn)移躍遷，電子從酚氧基配體軌道躍遷到硒離子的軌道。

注：DMY為二氫楊梅素。圖2 二氫楊梅素紅外光譜圖

3.5 TG 由圖3A可知，硒化二氫楊梅素在200 ℃以下時失重率為4.42%，為硒化二氫楊梅素分子外的吸附水[15]；在200～380 ℃區(qū)間的失重率為31.44%，為硒化二氫楊梅素的分解階段；二氫楊梅素在250 ℃處開始熔化分解，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致；在250～370 ℃區(qū)間硒化二氫楊梅素的失重率低于二氫楊梅素，而在400 ℃后失重率高于二氫楊梅素，推測該區(qū)間形成的硒化二氫楊梅素可能破壞了二氫楊梅素與H2O之間的相互作用力，使得熱穩(wěn)定性高于二氫楊梅素[17]；400 ℃以上基本母核和Se結(jié)合處同時分解，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性相對降低，也證明了硒化二氫楊梅素的合成。由圖3B可知，二氫楊梅素、硒化二氫楊梅素分解失重溫度分別為250、360 ℃，即后者熱穩(wěn)定性明顯提高。

注：DMY為二氫楊梅素。圖3 二氫楊梅素?zé)嶂厍€

3.6 XRD 由圖4可知，二氫楊梅素在13.82°、14.52°、15.94°、21.36°、25.92°、26.82°處有晶體衍射峰，Na2SeO3在17.74°、20.54°、24.20°、26.04°、32.44°、36.58°、45.00°、53.14°、60.80°處有晶體衍射峰，硒化二氫楊梅素的晶體衍射峰為8.96°、11.92°、14.58°、23.46°、26.88°、29.62°、36.14°、43.54°、45.26°；二氫楊梅素+Na2SeO3混合物具有兩者各自晶體衍射峰，不同于硒化二氫楊梅素，即它是通過化學(xué)反應(yīng)而成，而不是簡單的物理混合。

注：DMY為二氫楊梅素。圖4 二氫楊梅素XRD譜圖

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 由紫外分析結(jié)果可知，當(dāng)受熱溫度為10～100 ℃時，硒化二氫楊梅素特征吸收峰位置未發(fā)生明顯變化，即其溶液在30 min內(nèi)受熱溫度100 ℃以下時能穩(wěn)定存在；硒化二氫楊梅素溶液本身pH為6的特征吸收峰與調(diào)pH為酸性者基本一致，而與調(diào)pH為中性、堿性者不同，并且隨堿性增強(qiáng)特征吸收峰發(fā)生明顯變化，即它在酸性條件下穩(wěn)定，而在中性或堿性條件下不穩(wěn)定，并隨堿性增強(qiáng)更明顯；受熱時間為10～60 min時，硒化二氫楊梅素特征吸收峰的位置基本保持一致，即它在100 ℃下受熱60 min時仍穩(wěn)定存在。

3.8 抗氧化實(shí)驗(yàn)

3.8.1 還原力 物質(zhì)的抗氧化能力與還原力呈正相關(guān)，當(dāng)反應(yīng)體系中存在抗氧化物質(zhì)時，K3Fe (CN)6中的鐵離子的價(jià)態(tài)發(fā)生改變使溶液顏色改變，從而可知物質(zhì)的抗氧化能力[18]。由圖5可知，二氫楊梅素、硒化二氫楊梅素都具有還原力，并呈一定的量效關(guān)系，以后者更明顯。

注：DMY為二氫楊梅素。圖5 二氫楊梅素還原力

3.8.2 對·OH自由基的清除作用 由圖6可知，二氫楊梅素、硒化二氫楊梅素對·OH自由基的清除作用均呈一定的量效關(guān)系，在樣品質(zhì)量濃度為300 μg/mL時最強(qiáng)，以后者更明顯，表明硒化二氫楊梅素因共軛效應(yīng)使自氧化的氧陰離子自由基的電荷密度降低，穩(wěn)定性增加，有利于提高對·OH自由基的清除率，從而提高抗氧化活性[19]。

注：DMY為二氫楊梅素。圖6 二氫楊梅素對·OH自由基的清除率

3.8.3 對DPPH自由基的清除作用 由圖7可知，二氫楊梅素、硒化二氫楊梅素對DPPH自由基的清除率均隨著樣品質(zhì)量濃度增加變化不大，在300 μg/mL時最高，以前者更明顯，但后者整體也較理想，表明Na2SeO3與二氫楊梅素硒化時部分羥基氫被Se取代，使其數(shù)量減少，導(dǎo)致清除DPPH自由基作用降低[20]。

注：DMY為二氫楊梅素。圖7 二氫楊梅素對DPPH自由基的清除率

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)二氫楊梅素硒化修飾工藝為物料比1∶ 0.25，反應(yīng)時間120 min，反應(yīng)溫度95 ℃，反應(yīng)pH 8，產(chǎn)物熱穩(wěn)定性、水溶液穩(wěn)定性、抗氧化活性均良好，可為其進(jìn)一步研發(fā)提供基礎(chǔ)。