仙茅總黃酮提取純化工藝及其抗氧化、抗腫瘤活性

汪小玉，李 婷，稅丕先，張家偉，沈驊睿

(1.西南醫科大學藥學院，四川 瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000)

仙茅為石蒜科植物仙茅CurculigoorchioidesGaertn.的干燥根莖，具有補腎陽、強筋骨、祛寒濕等功效[1]，可用于增強肌腱和骨骼[2]，為歷版《中國藥典》收載，始載于《雷公炮炙論》[3]，《圣濟總錄》中記載古方“仙茅丸”可壯筋骨、宜精神[4]。成分研究顯示，仙茅成分主要包括酚及酚苷類[5]、三萜皂苷類[6]、木質素類[7]、黃酮類[8]等；藥理研究顯示，仙茅具有抗癌[9]、清除氧自由基[10]、免疫調節[11]、抗骨質疏松[12]、改善尿毒和腎毒[13]、保肝[14]等作用。

近年來，黃酮已成為研究熱點，其提取、純化方法也比較成熟，前者主要有酶輔助法、溶劑法、微波輔助法、超臨界CO2萃取法等方法，后者主要有大孔吸附樹脂/聚酰胺樹脂吸附法、機溶劑萃取法、制備型高效液相色譜法、高速逆流色譜法等[15]，并且該類成分具有清除自由基、抗氧化、抑菌作用[16]。目前，對仙茅的研究大多針對其酚苷類成分，如仙茅苷，而對黃酮的涉及較少，文獻報道有5,7-dimethoxmyricetin-3-O-α-L-xylopyranosyl-(4→1)-β-D-glucopyranoside、3′,4′,5′-三甲氧基-6,7-亞甲二氧基黃酮、2,3,4,7-四甲氧基黃酮[8]。前期報道，仙茅具有抗胃癌[17]、促進成骨細胞分化[18]等作用，故本實驗采用溶劑提取法、大孔吸附樹脂吸附法對該藥材總黃酮提取純化工藝進行優化，并初步評價其抗氧化、抗腫瘤活性，以期為其進一步開發利用提供理論依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 仙茅購自成都荷花池中藥材市場，經西南醫科大學藥學院莊元春副教授鑒定為石蒜科植物仙茅CurculigoorchioidesGaertn.的根莖。蘆丁對照品(純度99.47%)，購自成都曼斯特生物科技有限公司。D101、X-5、DM-130、AB-8、ADS-17、NKA-9大孔吸附樹脂，購自滄州寶恩有限公司；CCK-8試劑盒，購自武漢博士德生物技術公司；DPPH(C18H12N5O6)，購自成都潤澤本土化工有限公司；ABTS，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；Hoechst33258染色液，購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清、青鏈雙抗、PBS、0.25%胰酶消化液，購自以色列BI公司；抗壞血酸(Vc)、過二硫酸鉀、鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]、三氯乙酸、三氯化鐵、無水甲醇、無水乙醇，購自成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器 Synergy 2型全波長酶標儀，購自美國BioTek公司；TS2R-LS型倒置熒光顯微鏡，購自日本Nikon公司；ML204型電子天平，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BPN-150CRH型CO2培養箱，購自上海一恒科學儀器有限公司；UV-1700PC紫外可見分光光度計，購自上海鳳凰光學科儀有限公司。

1.3 細胞 人膽管細胞型肝癌細胞HCCC、人宮頸癌細胞Hela、人乳腺癌細胞M231均由西南醫科大學分子生藥學實驗室張春教授課題組惠贈，購自中國科學院上海細胞庫；人骨肉瘤MG-63細胞(MP-0046)，購自河南多沃生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定 精密稱取蘆丁對照品2.50 mg至25 mL量瓶中，60%乙醇溶解定容，分別吸取0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4 mL至10 mL量瓶中，參考文獻[19]報道的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 法進行顯色反應，在100～900 nm波長處進行掃描，發現在500 nm處有最大吸收，故選擇其作為檢測波長。以蘆丁質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)進行回歸，得方程為A=11.665X+0.039 4(R2=0.999 5)，在4～48 μg/mL范圍內線性關系良好。仙茅烘干(60 ℃)后粉碎，過40目篩，稱取10 g，加入20倍量(200 mL)70%乙醇，在85 ℃下回流提取2 h，過濾后定容至200 mL，取0.8 mL測定吸光度，計算含量，公式為含量=C×V/M(C為總黃酮質量濃度，V為提取液體積，M為藥材質量)。

2.2 提取工藝優化

2.2.1 單因素試驗 精密稱取仙茅粉末(過4號篩)2 g，以料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40)、提取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)、提取溫度(60、70、80、90、95 ℃)、乙醇體積分數(50、60、70、80、90%)為影響因素，考察它們對總黃酮得率的影響。

2.2.2 正交試驗 在單因素試驗基礎上，以總黃酮得率為評價指標，對料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、乙醇體積分數(D)進行考察，因素水平見表1，結果見表2，方差分析見表3。由此可知，各因素影響程度依次為D>B>A>C，其中B、D有顯著影響(P<0.05)，而A、C無顯著影響(P>0.05)。綜合考慮成本，最終確定最佳提取工藝條件為A1B3C1D3，即料液比1∶25，提取時間2.5 h，提取溫度85 ℃，乙醇體積分數80%。

表1 因素水平

表2 試驗設計與結果

表3 方差分析

2.2.3 驗證試驗 取藥材2.0 g，按“2.2.2”項下優化工藝進行3批驗證試驗，結果見表4，可知該方法重復性良好，工藝合理、穩定、可行。

2.3 純化工藝優化

2.3.1 樣品溶液制備 精密稱取藥材粉末(過4號篩)100.0 g，按“2.2.2”項下優化工藝提取，減壓濃縮干燥，稱取適量浸膏粉末，加水溶解至3 mg/mL，即得。

表4 驗證試驗結果(n=3)

2.3.2 樹脂型號篩選 取預處理好的6種樹脂各2.0 g，加入樣品溶液40 mL，室溫下振蕩吸附(90 r/min)12 h，上層液過濾，作為吸附液；載樣樹脂中加入70%乙醇40 mL，室溫下振蕩解吸(90 r/min)12 h，濾過，作為解吸液，測定吸附液、解吸液中總黃酮得率，計算靜態吸附率、解吸率、回收率，結果見表5。綜合比較后，最終選擇AB-8型樹脂進行純化。

表5 樹脂對總黃酮靜態吸附、解吸性能的影響

2.3.3 樹脂靜態吸附/解吸動力學特征 精密稱取預處理好的AB-8型樹脂1.0 g，加入20 mL樣品溶液，按“2.3.2”項下方法吸附與解吸，每0.5 h吸取上清液測定吸光度，計算吸附率、解吸率，繪制靜態吸附與解吸曲線，見圖1。由此可知，2 h內總黃酮吸附率升高最快，2 h后基本達到平衡，吸附率為70.31%；1.5 h內解吸率升高最快，1.5 h后達到解吸平衡，解吸率為86%。因此，選擇吸附時間為2 h，解吸時間為1.5 h。

2.3.4 各因素對吸附率與解吸率的影響 取樣品溶液，以上樣液質量濃度(0.5、1、2、3、4、5 mg/mL)、上樣液pH值(3、4、5、6、7、8)、上樣體積流量(0.5、1、2 mL/min)、洗脫液(乙醇)體積分數(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、洗脫體積流量(0.5、1、2 mL/min)為影響因素，考察各因素對吸附率、解吸率、總黃酮濃度的影響。由圖2A可知，總黃酮吸附率隨著上樣液質量濃度增大先升后降，在3mg/mL達到最大值，為72.99%，故選擇3mg/mL作為最佳上樣濃度。由圖2B可知，上樣液pH值大于7時，吸附率迅速下降；為4時有最大吸附率，為74.18%；但藥材原液pH值為5，吸附率為73.70%，接近最大吸附率，為減少實驗過程中繁瑣的操作步驟，最終選用pH值為5的原液上樣，同時流出液中黃酮濃度達到上樣液中其濃度的10%時，即為泄漏點[20]，由圖2C可知，上樣體積流量為0.5mL/min時樹脂達到泄漏點的上樣量最大，但綜合考慮吸附效率和吸附時間，最終確定為1mL/min，上樣體積為40mL，即4BV。由圖2D可知，以50%乙醇解吸時，解吸率為95.05%，達到最大值，之后隨著乙醇體積分數增大而逐漸降低，最終選用50%乙醇進行洗脫。由圖2E可知，隨著洗脫體積流量的增加，峰型逐漸變寬，洗脫率逐漸降低，但體積流量過小時洗脫時間會延長，考慮到工作效率及洗脫效果，選擇1mL/min作為最佳洗脫體積流量，洗脫體積為70mL(即7BV)時可洗脫完全。

圖1 樹脂靜態吸附、解吸曲線

圖2 各因素對AB-8樹脂吸附與解吸的影響

2.3.5驗證試驗 根據“2.3.4”項下最優純化工藝進行3批驗證試驗，測得總黃酮平均純度為40.72%，RSD為0.96%，表明該工藝穩定可靠，并且較純化前提高了4.39倍。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 清除DPPH自由基 參考文獻[21]報道的方法，將純化前后總黃酮及維生素C用乙醇配制成質量濃度為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的溶液，分別吸取100 μL于96孔板中，每個質量濃度設3個復孔，分別加入等量0.04 mg/mL DPPH溶液，混勻，室溫避光孵育30 min，517 nm波長處檢測每孔吸光度(A)。以維生素C為陽性對照，樣品溶液+無水乙醇為空白對照(A0)，無水乙醇+DPPH為對照組(A1)，計算DPPH自由基清除率，利用SPSS軟件計算總黃酮、維生素C對DPPH清除率達到50%時所需的質量濃度，分別用IC50(樣品)、IC50(維生素C)表示，并計算其抗壞血酸當量，用AEAC表示，即100 g仙茅總黃酮的抗氧化能力相當于多少毫克抗壞血酸，計算公式為自由基清除率={1-[(A-A0)/A1]}×100%、AEAC=IC50(維生素C)/IC50(樣品)×105，結果見圖3、表6。由此可知，純化前后總黃酮對DPPH自由基的清除能力均呈濃度依賴趨勢，在相同質量濃度下其強弱依次為維生素C>總黃酮純化后>總黃酮純化前，而且純化后的清除能力較純化前提高了2.83倍。

圖3 不同質量濃度總黃酮對DPPH自由基的清除率

表6 總黃酮對DPPH自由基的

2.4.2 清除ABTS自由基 制備ABTS工作液，方法為用1 mL純水溶解3.84 mg ABTS、0.67 mg過硫酸鉀，2種溶液按1∶1比例混合，室溫避光反應16 h，100 mmol/L pH7.4的PBS緩沖液稀釋21倍，使其在734 nm波長處吸光度為0.07±0.05。將純化前后總黃酮及維生素C加水制成質量濃度為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的溶液。按照文獻[22]報道的方法，吸取樣品、維生素C溶液各20 μL，置于96孔板中，每個質量濃度設3個復孔，每孔加入ABTS工作液200 μL，混勻，靜置10 min，在734 nm波長處測定吸光度。以維生素C為陽性對照，按“2.4.1”項下方法設置對照組，計算ABTS自由基清除率、AEAC，結果見圖4、表7。由此可知，總黃酮、維生素C對ABTS自由基的清除能力均與其質量濃度呈正相關，其程度依次為維生素C>總黃酮純化后>總黃酮純化前，而且純化后清除能力較純化前提高了4.12倍。

表7 總黃酮對ABTS自由基的

2.5 抗腫瘤活性研究

2.5.1 細胞培養 將人乳腺癌細胞M231、人骨肉瘤MG-63細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，人膽管細胞型肝癌細胞HCCC、人宮頸癌細胞Hela培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，均于37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖5 總黃酮對細胞存活率的影響

2.5.3 Hoechst 33258法細胞凋亡染色 參考文獻[22]報道的方法，設置對照組及總黃酮低、中、高劑量組(Hela、HCCC細胞，35、70、140 mg/L；MG-63細胞，50、100、200 mg/L；M231細胞，100、200、400 mg/L)，將對數生長期的4種細胞按照5×104/孔密度接種于24孔板中，每個細胞每種質量濃度設3個復孔，培養貼壁后分組給藥，24 h后加入0.5 mL無水甲醇，在4 ℃下固定細胞過夜，PBS緩沖液洗滌細胞3次，每孔加入Hoechst 33258染色液0.1 mL避光染色10 min，棄除染色液，加PBS緩沖液洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀察拍照，見圖6。由此可知，對照組中4種細胞均表現為完整的細胞形態，細胞核大小均勻，呈均一的藍色淡染；總黃酮組中4種細胞隨著劑量升高逐漸固縮、碎裂，細胞核表現出高亮的藍色濃染，表明該成分對其均有誘導凋亡作用。

注：A、B、C、D分別為Hela、HCCC、M231、MG-63細胞圖6 不同劑量下各組細胞形態(×200)

3 討論與結論

DPPH是氮族自由基，比較穩定，其溶液呈紫色，在樣品加入時能捕捉1個電子與其游離電子配對，反應后溶液變為黃色或無色，可以初步判斷樣品對DPPH自由基的清除能力；ABTS可與K2S2O8發生氧化反應，生成藍綠色的ABTS+，加入樣品溶液后又可被氧化為ABTS，變為無色溶液，吸光度也下降[24]。抗氧化實驗結果表明，仙茅總黃酮的抗氧化能力與其純度和濃度呈正相關，清除DPPH自由基的能力較清除ABTS+強，但其機理尚不明確，仍需進一步探究。

CCK-8可與細胞線粒體中的脫氫酶反應生成甲臜，后者呈橙黃色，活細胞數量越多，其產物的生成量越多，溶液顏色就越深[25]。Hoechst熒光染料能夠穿過細胞膜對細胞核進行染色，正常、凋亡細胞分別呈淺藍色、高亮藍色，常用于細胞凋亡檢測[26]。仙茅黃酮對4種腫瘤細胞株均有不同程度的增殖抑制、凋亡誘導作用，并表現出濃度依賴趨勢，其能力依次為Hela>HCCC>MG-63>M231，表明該成分是抗腫瘤活性的有效部位，對該藥材資源的進一步利用具有重要意義。后期，課題組將繼續探究仙茅黃酮抗腫瘤的機制，以期為相關新藥開發提供方向。