三子養親湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠脂質代謝紊亂的調控作用

李怡萍，楊麗麗，鄭 昱，周 鹽，黃 萍，鄭培永，宋海燕*

(1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院脾胃病研究所，上海 200032；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院脾胃病二科，上海 200032)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)包含了從單純肝脂肪變到非酒精性脂肪性肝炎的肝臟脂質異常沉積的相關疾病[1]，在成年人發病率為20%～33%，在肥胖人群高達75%[2]。NAFLD與代謝綜合征、2型糖尿病互為因果[3]，可進一步引發全身心腦腎血管疾病，已成為影響人類健康的主要慢性肝病之一[4]。由于NAFLD病理機制復雜，且是一種高度異質性疾病，目前臨床仍然缺乏明確有效的治療方法。

肝臟攝取的游離脂肪酸增多，脂肪酸氧化分解減少等造成脂質在肝細胞中過度沉積導致肝細胞發生脂肪變[5]，因此脂質代謝紊亂是NAFLD發生發展的關鍵環節。研究表明，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和沉默調節蛋白1(silent information regulater 1，SIRT1)信號通路是調節肝臟脂質代謝的重要通路，其活化異常是NAFLD發生發展的關鍵環節之一[6-9]。

三子養親湯，出自《韓氏醫通》，由萊菔子、紫蘇子和白芥子三味藥組成，具有順氣降逆、化痰消滯的功效[10]。中醫學者依據“辨證論治、異病同治”的治療思想，基于痰濕瘀阻互結、氣機郁滯的共同病機，以行氣化瘀、痰瘀同治為治療原則，采用三子養親湯治療脂肪肝、高脂血癥，取得較好療效[11-13]，但相關臨床試驗和動物實驗依據未見報道，其作用的生物學機制也不明確。因此本研究擬通過高脂飲食誘導建立NAFLD小鼠模型，觀察三子養親湯干預NAFLD的作用，并基于AMPK/SIRT1對脂質代謝的調控進一步探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物與飼料 5周齡SPF級雄性C57BL/6 J小鼠30只，體質量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號SCXK(滬)2017-0005。飼養于上海中醫藥大學附屬龍華醫院SPF級動物房，飼養室內溫度20～24 ℃，相對濕度45%～65%，晝夜光照12 h/12 h。基礎飼料(35%能量來源于脂肪)購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，高脂飼料(60%能量來源于脂肪)購自美國Research diet公司。

1.2 藥物 三子養親湯組方藥材炒萊菔子(上海虹橋中藥飲片有限公司，產地甘肅，批號190618)、炒紫蘇子(上海華濟藥業有限公司，產地浙江，批號2019062903)、炒白芥子(上海華濟藥業有限公司，產地山東，批號2019062202)，加水煮沸2次，藥液過濾并濃縮，于4 ℃保存備用。黃連素(美國Sigma公司，批號SLBB2771V，純度≥99%)；美能(復方甘草酸苷片，日本米諾發源制藥株式會社，批號18125)。

1.3 試劑 AMPK抗體(批號5831)、p-AMPK(批號2535)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)(批號3676)、p-ACC(批號11818)均購自美國Cell Signaling Technology公司；脂酰輔酶A氧化酶1(acyl coenzyme A oxidase 1，ACOX1)(批號00043617)、肉毒堿棕櫚酰轉移酶1(carnitine palmityl transferase 1，CPT-1 A)(批號00056856)、β-actin(批號10001832)均購自武漢三鷹生物技術有限公司；SIRT1(英國Abcam公司，批號GR3200692-2)。

1.4 儀器 FastPrep-24型均質器(美國MP Biomedicals公司)；CPA3235型電子天平(德國Sartorius公司)；StepOne Plus型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，SynergyH4型酶標儀(美國Bio-Tek公司)；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白電泳轉印系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 造模及給藥 小鼠適應性喂養1周后，按照體質量隨機分為對照組6只，造模組24只。按照文獻[14]報道，高脂飲食喂養16周，可導致小鼠肝組織出現明顯脂肪變性，胰島素抵抗等NAFLD相關表征。本實驗采用高脂飲食喂養22周，建立NAFLD小鼠模型，對照組給予正常飼料。22周造模完成后造模組根據體質量采用區組隨機的方法分為模型組、三子養親湯組、黃連素組和美能組，每組各6只。三子養親湯用藥劑量依據《中藥藥理學研究方法學》計算，按照成人臨床常規使用劑量進行等效劑量計算得小鼠給藥劑量為3.51 g/kg生藥量；黃連素劑量依據文獻報道及課題組前期實驗摸索[15-16]，采用100 mg/kg；美能藥物使用劑量按照臨床成人使用劑量進行人鼠等效換算為0.35 g/kg。用藥組予以相應藥物灌胃，對照組及模型組給予生理鹽水灌胃，每周記錄體質量。藥物干預8周后處死，取肝臟稱定質量，并收集血清及肝組織樣本檢測相關指標。

2.2 血脂檢測 末次給藥12 h后，小鼠禁食12 h，眼球取血，血液靜置30 min，常溫3 000 r/min 離心15 min，分離得血清。血清送至上海中醫藥大學附屬龍華醫院檢驗科，應用全自動生化儀檢測LDL-c、HDL-c、TC、TG水平，所需相關試劑均購自瑞士Roche公司。

2.3 HE染色檢測肝組織病理學變化 取5 mm×5 mm小鼠肝組織于4%中性多聚甲醛溶液中固定24 h，進行脫水、石蠟包埋、切片。將5 μm組織切片按照標準流程進行HE染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 油紅O染色檢測肝臟脂肪變性程度 取5 mm×5 mm小鼠肝組織，4%中性多聚甲醛溶液中固定，30%蔗糖脫水，OCT包埋后置于-80 ℃冰箱保存備用。制備10 μm肝組織冰凍切片，油紅O染液(異丙醇溶解的0.5%油紅O儲存液，使用前以3∶2加水稀釋并過濾)染色10 min，用85%甘油封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 RT-qPCR檢測肝組織脂質代謝相關基因的表達 應用Trizol法提取小鼠肝組織RNA，用ABI逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。基因序列通過Blast網上驗證，引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，引物序列見表1。選用SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒，在StepOnePlusTM實時熒光定量PCR系統中進行擴增反應，PCR擴增條件為95 ℃ 30 s變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s退火和延伸，重復40個循環。以β-actin為內參，用2-△△CT法分析計算基因相對表達量。

表1 引物序列

2.6 Western blot檢測肝組織中脂質代謝相關蛋白的表達 稱取肝組織100 mg，加入RIPA裂解液，使用均質器進行組織勻漿，冰上靜置30 min后，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。取等量蛋白采用10% SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉后，加入一抗4 ℃搖床過夜孵育。TBST洗膜后，加入相應二抗，繼續室溫孵育2 h，應用化學發光法顯影。采集條帶圖片后用圖像分析軟件Image J分析各條帶光密度值，通過目的條帶與內參(β-actin)光密度比值進行半定量分析。

3 結果

3.1 三子養親湯對NAFLD小鼠體質量、肝質量的影響 如圖1所示，與對照組比較，模型組小鼠體質量、肝質量升高(P<0.01)；與模型組比較，三子養親湯組及黃連素組小鼠體質量、肝質量均降低(P<0.05，P<0.01)，美能組小鼠體質量有降低趨勢，但差異沒有統計學意義(P>0.05)。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 三子養親湯對NAFLD小鼠體質量、肝質量的影響

3.2 三子養親湯對NAFLD小鼠血脂的影響 如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清TC、HDL-c、LDL-c水平升高(P<0.01)；與模型組比較，三子養親湯組、黃連素組及美能組小鼠血清TC、HDL-c、LDL-c水平均降低(P<0.05，P<0.01)；各組TG水平均無明顯變化(P>0.05)。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 三子養親湯對NAFLD小鼠血脂的影響

3.3 三子養親湯對NAFLD小鼠肝組織病理的影響 如圖3所示，對照組小鼠肝臟結構清晰，肝小葉結構正常，肝細胞呈條索狀排列；模型組小鼠肝小葉結構欠清晰，在中央靜脈周圍彌漫性分布大泡性為主的脂肪變性，伴有炎性細胞浸潤，并出現肝細胞氣球樣變性；與模型組比較，三子養親湯組、黃連素組小鼠肝組織病理變化得到明顯改善，脂肪變性程度顯著減輕，無明顯炎性細胞浸潤灶，美能組小鼠病理變化有所改善，但療效不明顯。

圖3 各組小鼠肝組織HE染色(×200)

3.4 三子養親湯對NAFLD小鼠肝組織脂肪變程度的影響 如圖4所示，對照組小鼠肝組織僅見少量紅色小脂滴；模型組小鼠肝組織可見彌漫性分布的紅色脂滴浸潤，脂滴體積較大，部分融合成片；三子養親湯組小鼠肝組織脂滴含量顯著減少，且脂滴體積顯著減小。

圖4 小鼠肝組織油紅O染色(×200)

3.5 三子養親湯調控AMPK/SIRT1信號通路 如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中AMPK蛋白磷酸化表達和SIRT1 mRNA和蛋白表達均降低(P<0.01)；與模型組比較，三子養親湯組小鼠AMPK蛋白磷酸化表達和SIRT1 mRNA和蛋白表達均升高(P<0.01)。

注：A為AMPK、SIRT1蛋白表達；B為SIRT1 mRNA表達。與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖5 各組小鼠肝組織AMPK、SIRT1的表達

3.6 三子養親湯對AMPK/SIRT1調控的脂質代謝相關分子表達的影響 如圖6A所示，與對照組比較，模型組p-ACC、脂肪酸氧化分子CPT-1 A、ACOX1蛋白表達均降低(P<0.01)；與模型組比較，三子養親湯組p-ACC、CPT-1 A、ACOX1蛋白表達均升高(P<0.01)。如圖6B所示，與對照組比較，模型組PPARα、CPT-1 A、PGC-1α mRNA表達均降低(P<0.01)，FASN mRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，三子養親湯組PPARα、CPT-1 A、PGC-1α mRNA表達均升高(P<0.05，P<0.01)，FASN mRNA表達降低(P<0.01)。

4 討論

三子養親湯是治療頑固性咳嗽、慢性阻塞性肺炎、慢性支氣管炎等肺系病癥的經典方[17]，由萊菔子、紫蘇子和白芥子3味藥組成。方中萊菔子消食導滯，下氣祛痰；紫蘇子可降氣化痰、潤腸通便、止咳平喘；白芥子辛溫，利氣散結祛痰而不耗氣。三藥相配，共奏順氣降逆，化痰消食之功。臨床上根據“異病同治”這一治療原則，基于痰濕瘀阻互結，氣機郁滯的共同病機，使用該方治療脂肪肝、高脂血癥、2型糖尿病等代謝相關性疾病，取得良好療效[12,18-19]。

本研究結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠體質量、肝質量增加，肝組織出現彌漫性脂肪變性，血清TC、HDL-c、LDL-c水平均升高。與人類NAFLD患者血清HDL-c水平降低不同，模型組小鼠血清HDL-c水平升高，是由于小鼠在ApoA1(HDL的主要載脂蛋白)的啟動子區域缺乏PPAR反應元件所致[20]；與模型組比較，黃連素組、美能組小鼠肝質量、肝組織病理及血脂得到改善，三子養親湯干預可減輕NAFLD小鼠體質量、肝質量，改善肝組織脂肪變性和炎性細胞浸潤，并降低血脂水平，證實三子養親湯具有改善NAFLD的作用。

脂質代謝紊亂是NAFLD的形成原因之一。AMPK是細胞能量穩態調節器，AMPK被激活后可抑制脂肪酸合成，促進脂肪酸β氧化[21-22]。AMPK可磷酸化其下游分子ACC，抑制其活性，從而抑制脂肪酸的合成，增加CPT-1 A的活性從而促進脂肪酸β氧化[23]。研究也表明，AMPK可降低FASN的表達，減少脂質的合成，增加PPARα、ACOX1、PGC-1α的表達，促進脂肪酸氧化[24-26]。SIRT1是NAD+依賴的去乙酰化酶[27]，與AMPK的活化相互促進，共同調節細胞內脂質代謝[28-29]。本研究顯示，與對照組比較，模型組AMPK磷酸化、SIRT1表達均降低，三子養親湯組其表達升高。并且，NAFLD模型組失活的ACC表達降低，促進脂肪酸氧化基因CPT-1A、ACOX1、PPARα、PGC-1α的表達降低，促進脂肪酸合成的FASN表達上調，藥物干預可上調p-ACC、CPT-1 A、ACOX1、PPARα、PGC-1α的表達，降低FASN的表達，提示三子養親湯可能通過調控AMPK/SIRT1調控脂質代謝相關分子信號通路，從而發揮改善肝細胞脂質代謝的作用。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖6 各組小鼠肝組織中脂質代謝相關分子的表達

綜上所述，本研究結果表明，三子養親湯可改善NAFLD，其作用機制可能與促進AMPK/SIRT1信號通路活化調控脂質代謝紊亂有關，本研究為該經典方劑治療脂肪肝的臨床應用提供實驗依據。