速效救心丸經ALKBH5/m6A調控自噬減輕缺氧/復氧心肌細胞損傷

王可妍，高俊杰，林文勇，王 丹，張春伶，牛振超，李益萍*，王肖龍*

(1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，國家中醫心血管病臨床醫學研究中心分中心，上海 201203；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院心血管病研究所，上海 201203)

急性心肌梗死是發病率和死亡率很高的主要心血管疾病之一，其干預的最佳治療手段是再灌注治療。然而，在再灌注過程中會導致額外的心肌損傷，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI)[1-3]。治療MIRI的方法主要有機械性物理療法(低溫療法、遠隔缺血后適應等)及藥物治療(心房利鈉肽、環孢霉素A等)，然而臨床試驗并未證實其確切療效[4-6]。因此，MIRI成為研究的熱點和難點。

MIRI發病機制復雜，自噬在其病理過程中發揮重要作用[7]。N6-腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)甲基化是RNA重要的表觀遺傳學修飾，m6A甲基化水平主要由甲基化酶如甲基化酶3 (methyltransferase-like 3,METTL3)和去甲基化酶如ALKBHB同源蛋白5 (alkylation repair homolog protein 5,ALKBH5)調控[8]。Song等[9]研究發現缺氧/復氧后 METTL3表達上調，m6A甲基化水平增加，進而損害自噬通量，促進心肌細胞凋亡，提示m6A甲基化修飾可能通過影響自噬從而參與MIRI的病理過程。

速效救心丸主要由川芎嗪、冰片組成。臨床發現其可顯著改善心肌梗死及心絞痛等癥狀[10-12]。本課題組預實驗研究發現速效救心丸可以減少大鼠心肌梗死面積，改善心功能，從而減輕缺血再灌注損傷，并與自噬機制有關。本研究通過缺氧/復氧心肌細胞模型，從表觀遺傳學與自噬角度深入探討速效救心丸對MIRI的保護作用，為其臨床運用提供更加充分的理論依據。

1 材料

1.1 細胞 大鼠心肌細胞H9c2細胞購自上海諾百生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 速效救心丸(天津中新藥業集團股份有限公司，批號617135)，其濃度的選擇基于前期基礎研究，分別用無水乙醇將速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片稀釋溶解至50、100、25 mg/mL，與細胞共培養時使其給藥終質量濃度為50、100、25 μg/mL。BCA蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、蛋白Marker、CellTiter-LumiTMSteady發光法細胞活力檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號0701018181104、P0012AC、061418181119、C0069S)；DMEM高糖培養基(美國Corning公司，批號32320006)；PBS (上海昱都生物科技有限公司，批號AF29526788)；0.25% Trypsin-EDTA[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，批號193154]；SYBR RT-qPCR Master Mix、RNA抽取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號Q341-02、7E552A1)；GoScriptTMReverse Transscription (美國Promega公司,批號0000389033)；ALKBH5(英國Abcam公司，批號ab195377)；GAPDH (美國Proteintech公司，批號051201)；二抗(合肥白鯊生物科技有限公司，批號69110200)；EpiQuik m6A RNA甲基化定量檢測試劑盒(美國Epigentek 公司，批號P-9005)。

1.3 儀器 超凈工作臺(珠海市再鑫儀器有限公司)；Forma311型CO2細胞培養箱、StepOnePlus Real-Time PCR儀(美國Thermo公司)；SDS-PAGE電泳儀、濕轉轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；5430R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 缺氧/復氧模型的建立及復氧時間的確定 H9c2細胞培養在含10%胎牛血清的高糖DMEM中，5% CO2培養箱中傳代培養至第3代后建立缺氧/復氧模型。更換培養基為低糖無血清的DMEM，在缺氧條件下(1% O2、94% N2、5% CO2)培養2 h后再復氧(95%空氣，5% CO2)，分別復氧0、2、4、6 h。

2.2 化學發光法檢測細胞活力 通過CellTiter-LumiTMSteady發光法細胞活力檢測試劑盒檢測不同復氧時間組的ATP水平來確定最佳復氧時間。使用滿足化學發光檢測條件的96孔板，之后進行細胞鋪板，5% CO2，37 ℃，過夜培養。室溫平衡10 min，向每孔中加入發光法檢測試劑，室溫振蕩2 min，室溫孵育10 min，使發光信號趨于穩定。使用具有檢測化學發光功能的多功能酶標儀進行檢測。

2.3 實驗分組 H9c2細胞鋪板密度在30%～40%之間，隨機分為常氧組、缺復/復氧組、速效+缺氧/復氧組、川芎嗪+缺氧/復氧組、冰片+缺氧/復氧組，藥物預處理1 h之后進行缺氧/復氧處理，待到規定時間后收集細胞mRNA和蛋白。

2.4 Western blot檢測ALKBH5的表達 提取各組細胞蛋白，BCA試劑盒蛋白定量后變性，上樣、電泳、轉膜，脫脂奶粉封閉，加入ALKBH5一抗(1∶2 000)，4 ℃過夜孵育，洗膜后加入二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h，洗膜，顯影。

2.5 Human ALKBH5過表達慢病毒制備 根據ALKBH5(NM_017758.3)基因信息，針對CDS區進行基因合成，并將其構建入慢病毒表達載體骨架PDS085_pL-MCS(用NheI和AscI酶切)中，即獲得慢病毒表達載體pl-CMV-ALKBH5。

2.6 轉染實驗分組 H9c2細胞鋪板密度在30%～40%之間，隨機分為空白轉染+常氧組、空白轉染+缺氧/復氧組、空白轉染+速效預處理+缺氧/復氧組、空白轉染+川芎嗪+缺氧/復氧組、空白轉染+冰片+缺氧/復氧組、ALKBH5過表達+缺氧/復氧組、ALKBH5過表達染+速效+缺氧/復氧組、ALKBH5過表達+川芎嗪+缺氧/復氧組、ALKBH5過表達+冰片+缺氧/復氧組。

2.7 慢病毒轉染細胞 從培養箱中取出細胞，吸去舊培養基，將含病毒的培養液小心加入各孔中，放于CO2培養箱孵育4～6 h，吸去含病毒的培養液，PBS清洗細胞2～3次，最后加入適量培養液，過夜后觀察細胞狀態。

2.8 RT-qPCR檢測相關基因的表達 采用RT-qPCR法對相關基因表達進行定量分析。用TRIzol試劑提取心肌細胞總RNA，逆轉錄獲取cDNA，SYBR Green PCR Master Mix Kit 用于量化RNA水平，以β-actin作為內參，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.9 比色法檢測m6A甲基化水平 提取樣品RNA，每次反應的總RNA量可為100～300 ng，每個反應的最佳量為200 ng。制備緩沖液與溶液，與RNA結合，捕獲m6A RNA，使用酶標儀檢測信號，計算m6A的水平。

2.10 統計學分析 通過SPSS 25.0軟件進行處理，符合正態性及方差齊性，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態性和(或)方差齊性，組間比較使用非參數檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 H9c2細胞不同復氧時間對細胞活力的影響 如圖1所示，不同復氧時間組的細胞活力均低于常氧培養細胞(P<0.01)；其中復氧4 h可以較好的恢復細胞活力。因此后續缺氧/復氧模型均采取缺氧2 h，復氧4 h。

注：與同一復氧時間常氧組比較，**P<0.01。圖1 不同復氧時間心肌細胞活力

3.2 速效救心丸預處理對細胞狀態的影響 如圖2所示，常氧組細胞生長狀態良好，死亡細胞較少；與常氧組比較，缺氧/復氧組細胞死亡增加(P<0.01)；速效救心丸、川芎嗪及冰片預處理可減少缺氧/復氧后心肌細胞的死亡，促進增殖(P<0.01)。

3.3 速效救心丸預處理對缺氧/復氧心肌細胞ALKBH5表達的影響 如圖3所示，與常氧組比較，缺氧/復氧組細胞去甲基化酶ALKBH5的mRNA和蛋白表達升高，其中mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05),蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與缺氧/復氧組比較，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片預處理均可增加缺氧/復氧后心肌細胞ALKBH5 mRNA 和蛋白表達(P<0.01)。

3.4 速效救心丸預處理及ALKBH5過表達對缺氧/復氧心肌細胞m6A甲基化水平的影響 如圖4所示，與缺氧/復氧組比較，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片預處理可降低m6A水平(P<0.01)，ALKBH5過表達處理后也可下調m6A水平(P<0.01)。

注：與常氧組比較，**P<0.01；與缺氧/復氧組比較，##P<0.01。圖2 速效救心丸對缺氧/復氧后心肌細胞的影響

注：與常氧組比較，*P<0.05；與缺氧/復氧組比較，##P<0.01。圖3 速效救心丸對ALKBH5表達的影響

3.5 速效救心丸預處理及ALKBH5過表達對缺氧/復氧心肌細胞活力的影響 如圖5所示，與缺氧/復氧組比較，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片預處理可提高缺氧/復氧后心肌細胞的活力(P<0.01)；與缺氧/復氧組比較，ALKBH5過表達處理也可增加心肌細胞活力(P<0.01)。

3.6 速效救心丸預處理及ALKBH5過表達對缺氧/復氧心肌細胞自噬的影響 如圖6所示，與常氧組比較，缺氧/復氧組心肌細胞GSK3β、Atg5、Beclin1、P62 mRNA表達均升高(P<0.01)，mTORmRNA表達降低(P<0.01)；與缺氧/復氧組比較，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片預處理可抑制GSK3β、Atg5、Beclin-1、P62 mRNA表達(P<0.01)，促進mTORmRNA表達(P<0.01)；與缺氧/復氧組比較，ALKBH5過表達也可抑制GSK3β、Atg5、Beclin-1、P62 mRNA表達，促進mTORmRNA表達(P<0.01)。

4 討論

在心肌缺血再灌注過程中，自噬被明顯激活，超過一定水平時會導致細胞功能障礙，從而發生自噬性細胞死亡[13-14]，因此，抑制過度自噬可能成為治療MIRI的一個有效靶點。參與自噬調控的經典信號通路之一是GSK3β/mTOR通路，一些關鍵蛋白可直接或間接反映自噬過程[15-16]。Beclin 1是自噬起始階段的關鍵調控分子，調控早期自噬小體的形成。微管相關蛋白輕鏈3蛋白(microtubulerassociated protein light chain 3 protein,LC3)是Beclin1蛋白的關鍵下游因子，是檢測自噬發生的標志性蛋白。Atg5也參與自噬體的形成[17-20]。P62的主要功能是將被降解的細胞器運輸至成熟的自噬體[21]。隨著對表觀遺傳學的深入研究發現，m6A修飾與自噬密切相關。

注：與空白轉染+常氧組比較，**P<0.01；與空白轉染+缺氧/復氧組比較，##P<0.01；與ALKBH5過表達+缺氧/復氧組比較，&&P<0.01。圖4 速效救心丸與ALKBH5過表達對心肌細胞m6A甲基化水平的影響

注：與空白轉染+常氧組比較，**P<0.01；與空白轉染+缺氧/復氧組比較，##P<0.01；與ALKBH5過表達+缺氧/復氧組比較，&&P<0.01。圖5 速效救心丸與ALKBH5過表達對心肌細胞活力的影響

注：與空白轉染+常氧組比較，**P<0.01；與空白轉染+缺氧/復氧組比較，##P<0.01；與ALKBH5過表達+缺氧/復氧組比較，&&P<0.01。圖6 速效救心丸與ALKBH5過表達對心肌細胞自噬的影響

本課題組發現，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片可有效改善缺氧/復氧心肌細胞損傷；缺氧/復氧后心肌細胞去甲基化酶ALKBH5 mRNA表達略增加，蛋白表達差異無統計學意義；而速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片預處理可增加去甲基化酶ALKBH5的表達，下調m6A甲基化水平；抑制GSK3β、Beclin-1、Atg5、P62的表達，增加mTOR的表達。采用慢病毒轉染技術使去甲基化酶ALKBH5過表達，ALKBH5過表達后缺氧/復氧心肌細胞m6A甲基化水平下降、細胞活力增加，GSK3β、Beclin-1、Atg5、P62的表達下降，mTOR的表達增加，表明速效救心丸可能通過ALKBH5/m6A途徑抑制過度自噬從而減輕缺氧/復氧心肌細胞損傷。此外，本課題組發現速效救心丸拮抗缺血再灌注損傷的作用優于單體川芎，弱于單體冰片，提示速效救心丸減緩缺血再灌注損傷主要是通過冰片發揮作用，其用量較少，且在藥物服用安全范圍內，故對人體無害。

然而，本實驗并未在蛋白層次上探索自噬相關指標的變化，其中LC3相對mRNA表達結果無統計學意義，故在以后的研究中應通過Western blot等技術來深入對自噬通路的研究。另外，應增加干擾ALKBH5表達后對缺氧/復氧心肌細胞的影響，以期為速效救心丸治療MIRI提供更加充足的證據。MIRI目前尚無有效的治療方法，但研究發現我國傳統中藥，如五參順脈膠囊、三七總皂苷等通過抑制過度自噬減輕缺血再灌注損傷[22-25]，未來需要更多相關研究來推動我國傳統中醫藥衛生事業的發展。