基于網絡藥理學和分子對接探討桿努盡煙治療慢性支氣管炎的作用機制

袁桃花，黃雨霄，殷智鑫，石 雪，胡 盼，孫見飛，劉 華，徐 紅，吳 寧*

(1.貴州醫科大學基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學臨床醫學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550025)

慢性支氣管炎是一種常見的慢性呼吸系統疾病，臨床多以反復的咳嗽、咳痰或伴喘息的慢性病程為特征[1-2]，常用抗生素、氣管舒張藥物等西藥進行治療，起效快且療效明顯，但慢性支氣管炎病程長且易復發，長期服用，副作用較大[3]。中草藥有整體調節、多途徑、多環節的特點，療效持久，短期內病癥復發現象少，毒副作用小，可長期堅持服用，使其在治療慢性支氣管炎方面顯示出明顯優勢[4]。桿努盡煙(苗藥名Cherh nex jenl vieeb)是貴州凱里苗族地區治療慢性支氣管炎的特色藥方，藥源豐富、應用范圍廣、歷史長、療效顯著，但其作用機制尚不明確，仍處于經驗用藥階段[5-6]。網絡藥理學的整體性和系統性與中草藥特征不謀而合，為中藥方劑潛在活性成分與作用靶點的深入研究開辟新手段[7-8]。因此，本研究基于網絡藥理學方法，獲得桿努盡煙治療慢性支氣管炎的主要活性成分、關鍵靶標及信號通路，并構建慢性支氣管炎大鼠模型，對篩選出的關鍵通路中重要靶點進行動物實驗驗證，探究苗藥桿努盡煙治療慢性支氣管炎的分子機制，為深入研究桿努盡煙治療慢性支氣管炎的作用機制奠定理論基礎。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠30只，雄性，體質量(200±20)g，購自重慶騰鑫生物技術有限公司，實驗動物使用許可證號SYXF(黔)2018-0001。

1.2 試劑與藥物 貴煙黃果樹藍佳品(焦油量10 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，一氧化碳量12 mg，貴陽卷煙廠)；桿努盡煙全草采自貴州省凱里市爐山鎮，經貴陽中醫藥大學潘爐臺教授鑒定為吊石苣苔屬植物吊石苣苔LysionotuspauciflorusMaxim.。桂龍咳喘寧膠囊(大連天山藥業有限公司，國藥準字Z20050149)。TNF-α酶聯免疫試劑盒(批號A38281155)、NF-κB p65兔抗大鼠一抗(批號3560144117)、qPCR反應試劑盒(批號Q311-02，南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

1.3 儀器 SynGeneTM凝膠成像系統(美國Synoptics公司)；ABI StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)。

2 方法

2.1 桿努盡煙潛在活性成分篩選 通過TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)及化學專業數據庫(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm?nCount=13303008)發掘桿努盡煙的化學成分，文獻資料進行補充，根據成分的吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)及排泄(Excretion)，即ADME參數篩選有效成分[7]，篩選條件為藥物口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18，結合文獻資料保留對慢性支氣管炎有效、活性大的成分[5]，利用PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/#query=Nevadensia)對篩選出的藥物活性成分的SMILES化學式進行補充。

2.2 活性成分潛在靶點預測與篩選 采用TCMSP數據庫預測篩選桿努盡煙有效成分作用靶點，通過SwissTargetPredicition數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)補充空缺成分靶點，并輸入UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)，限定物種為人，將名稱校正，獲取UniProt號。

2.3 “桿努盡煙活性成分-靶點”網絡構建 將活性成分與靶點整理后導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建“桿努盡煙活性成分-靶點”網絡圖。

2.4 慢性支氣管炎靶點檢索 以“Chronic bronchitis”為關鍵詞，通過TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、Durgbank數據庫(https://www.drugbank.ca/)、DisGeNT數據庫(https://www.disgenet.org/)檢索慢性支氣管炎靶點，取交集并去重，獲得UniProt號。

2.5 桿努盡煙活性成分治療慢性支氣管炎作用靶點預測 利用藥物靶點和慢性支氣管炎靶點，通過VENNY 2.1軟件繪制Venn圖，將圖中交集靶點輸入String Version 10.5數據庫(https://string-db.org/)，限定物種為人，并隱藏出現的游離蛋白，獲得桿努盡煙-慢性支氣管炎蛋白互作(PPI)網絡圖，并利用Cytoscape Version 3.6.1軟件進行可視化分析。

2.6 分子對接 利用sybyl-x 2.0進行配體分子的前處理，小分子加Gasteiger-Huckel電荷，設置最大優化步數10 000，初始優化的能量梯度收斂條件0.005 kcal/(mol*A)，能量優化算法為Powell，其他值為系統默認。靶標蛋白前處理在sybyl-x2.0中進行：蛋白質分子全部除去晶體水、加氫并除去占據結合位點的共結晶配體分子，補上缺失氨基酸殘基及末端殘基，設定氨基酸質子化狀態，賦予力場為AMBER7 FF99，Kollman電荷。利用AutoDockTools(ADT)生成對接所需的pdbqt文件，最后用AutoDock-vina軟件計算得到九個優勢結合構象，以打分最高(結合能力最強的構象)記錄各配體分子與靶標間的結合能大小[9]。

2.7 關鍵靶點的富集分析 用DAVID 6.8數據庫(http：//www.david.niaid.nih.gov)對上述關鍵靶點進行GO富集和KEGG通路分析，其中GO注釋包括生物學過程(BP)、細胞組成(CC)和分子功能(MF) 模塊，KEGG通路篩選以P<0.05作為顯著性強的臨界篩選，以Count值降序排列，列出桿努盡煙活性成分治療慢性支氣管炎的前15位關鍵通路。

2.8 分組與造模 SD大鼠分為正常對照組，模型組，桿努盡煙高、低劑量組，陽性藥物組(桂龍咳喘寧)，每組6只。將正常對照組置于無煙環境中飼養，其余各組均采用煙熏聯合脂多糖氣管注射法復制慢性支氣管炎大鼠模型[10]。制備被動吸煙箱(55 cm×45 cm×35 cm，上壁留有通氣孔)。第1天和第14天以8%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，氣道內注射200 mg/mL脂多糖溶液0.2 mL，手術當天不作煙熏，其余時間各組大鼠每次用4只香煙煙熏，每天2次，每次30 min。造模28 d后，每組隨機取1只大鼠，用4%多聚甲醛灌注處理，取左肺上葉制作HE切片，鏡下觀察大鼠肺組織病理改變，驗證造模成功。

2.9 桿努盡煙水提液制備 取2 kg桿努盡煙，蒸餾水浸泡，于90 ℃電熱恒溫水箱中連續浸提12 h，收集并過濾浸提液；合并浸提液，濃縮至生藥量為2.5 kg/L，分裝滅菌，置于4 ℃冰箱保存備用。

2.10 給藥 造模結束后第2天開始給藥，桿努盡煙高、低劑量組大鼠分別灌胃給予桿努盡煙水提液8、2 g/kg(按生藥量計)，陽性藥物組灌胃給予桂龍咳喘寧1 g/kg，正常對照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水，每天1次，連續給藥28 d。

2.11 肺組織采集 麻醉大鼠，心臟取血，打開胸腔，取下肺組織，將左肺上葉固定于4%多聚甲醛中，用于制作HE切片；另取右肺經RNA保存液處理后置于-80 ℃冰箱保存，用于后續指標的檢測。

2.12 病理組織切片制作 操作流程為常規脫蠟→染色→水洗→分化→漂洗→脫水Ⅰ→復染→脫水Ⅱ→烤片→中性樹膠封片→顯微鏡下觀察支氣管及肺組織病理形態學變化。

2.13 ELISA法檢測肺組織中TNF-α水平 取50 mg肺組織，置于研缽中，用眼科剪快速剪碎組織塊，加入PBS，充分研磨，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液，根據ELISA試劑盒說明書操作，檢測細胞因子TNF-α水平。

2.14 RT-qPCR檢測肺組織NF-κBmRNA表達 Trizol法提取大鼠肺組織勻漿總RNA，取1 μg RNA進行逆轉錄，按說明書合成cDNA。內參照GADPH、NF-κB引物序列見表1。按qPCR反應試劑盒說明書進行反應，反應條件為預變性95 ℃ 5min；循環反應為95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；熔解曲線為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，采用2-△△CT法進行相對定量分析，以GAPDH為內參。

表1 引物序列

2.15 Western blot檢測NF-κB蛋白表達 實驗操作步驟依次為提取蛋白→BCA法進行蛋白濃度定量→蛋白變性→SDS-PAGE電泳后轉膜→5%脫脂奶粉封閉→加入一抗，4 ℃過夜→TBST洗膜3次→加入二抗，室溫下振蕩2 h→洗滌后將PVDF膜置于ECL混合液中→應用凝膠成像系統對掃描圖像的目的條帶→進行灰度分析。

3 結果

3.1 桿努盡煙潛在活性成分篩選結果 去除重復成分后，共得到8種，同時滿足OB≥30%和DL≥0.18或結合文獻報道對慢性支氣管炎有效且滿足其中1個條件的桿努盡煙活性成分共5種，見表2。

表2 桿努盡煙潛在化學成分

3.2 繪制“桿努盡煙活性成分-關鍵靶點”網絡圖 共獲得5種活性成分靶點514個，刪除重復并去除假陽性項，整合得到苗藥桿努盡煙作用靶點共340個。“桿努盡煙活性成分-關鍵靶點”網絡圖(圖1)顯示，5種關鍵成分共同作用的靶點有8個，包括11號染色體的基因(BACE1)、誘導型—氧化氮合酶(NOS2)、蛋白酪氨酸磷酸酶—非受體1型(PTPN1)、花生四烯5-脂氧合酶基因(ALOX5)、雌激素受體2(ESR2)等，其中ALOX5、PTPN1等能介導慢性支氣管炎炎癥反應，提示這些靶點可能是桿努盡煙的作用于慢性支氣管炎的靶點。

注：LPM-1～LPM-5分別為1-(4-羥基-3-甲氧苯基)乙酮、3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸、β-谷甾醇、石吊蘭素、熊果酸。菱形代表桿努盡煙成分，橢圓形代表靶點；自由度越大，顏色越深。圖1 “桿努盡煙活性成分-關鍵靶點”網絡圖

3.3 桿努盡煙活性成分治療慢性支氣管炎作用靶點預測 檢索整合得到的慢性支氣管炎靶點共103個，將其與桿努盡煙活性成分作用靶點進行基因映射，共得潛在作用靶點23個，見圖2。

圖2 “桿努盡煙-慢性支氣管炎”基因映Venn圖

3.4 桿努盡煙-慢性支氣管炎蛋白互作(PPI)網絡分析 桿努盡煙-慢性支氣管炎蛋白互作(PPI)網絡圖中(圖3A)，去除2個游離蛋白，該圖包括23個節點，55條邊，平均自由度為4.78，其中互作蛋白評分≥0.9的包括NR3C2-NR3C1、CYP1B1-ADORA1、NR3C2-PGR、CHRM2-ADORA3等。利用Cytoscape Version 3.6.1軟件對PPI網絡圖進行可視化，得到桿努盡煙-慢性支氣管炎蛋白互作(PPI)網絡圖(圖3B)，該圖包括21個節點，平均自由度為5.24，得到自由度大于平均自由度的的靶點共7個，按自由度從高到低排序依次為ALB、CYP1A1、CYP1B1、ADORA1、PGR、NR3C1、GSTP1、CYP1A2，見表3。

圖3 桿努盡煙-慢性支氣管炎蛋白互作(PPI)網絡圖

表3 PPI網絡關鍵節點及其拓撲參數

3.5 桿努盡煙-慢性支氣管炎靶點網絡圖 桿努盡煙-慢性支氣管炎靶點網絡圖(圖4)中包含節點74個，靶標37個，其中ALOX5、多藥耐藥性蛋白(ABCB1)靶點的介數較大，被預測為桿努盡煙治療慢性支氣管炎的靶點，其次是腺苷受體A3(ADORA3)、核受體亞家族3C組成員1/2(NR3C1/2)、膽堿能受體毒蕈堿2(CHRM2)、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員6(SERPINA6)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)、細胞色素P450家族1亞家族B成員1(CYP1B1)等發揮治療慢性支氣管炎的可能性較大。

圖4 桿努盡煙-慢性支氣管炎靶點網絡圖

3.6 分子對接分析 利用AutoDock-vina軟件對桿努盡煙的5種主要活性成分與篩選出的關鍵靶點(ALOX5、CYP1A1、CYP1B1、TNF-α、NF-κB、ADORA1)進行分子對接，對接模式見圖5，對接親合能量值見表4。桿努盡煙的成分中熊果酸、β谷甾醇、石吊蘭素分別與TNF-α和NF-κB親和能量值低，其中熊果酸親和力最強。3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸、1-(4-羥基-3-甲氧苯基)乙酮與ALOX5親合力較強，3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸親和力較強。石吊蘭素、3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸、1-(4-羥基-3-甲氧苯基)乙酮與CYP1A1和CYP1B1的親和能低，其中石吊蘭素親和力最強。β谷甾醇、熊果酸、石吊蘭素與ADORA1親合能低，β谷甾醇親和力最強。從以上結果可知，CYP1A1、CYP1B1、ADORA1、TNF-α、NF-κB可能為桿努盡煙治療慢性支氣管炎的主要靶點。

注：A～E分別為TNF-α與熊果酸、NF-κB與熊果酸、ALOX5與3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸、CYP1A1與石吊蘭素、CYP1B1與石吊蘭素、ADORA1與β谷甾醇。圖5 主要化合物與靶點最優結合模式圖

3.7 關鍵靶點的富集分析 采用DAVID軟件篩選“桿努盡煙”治療慢性支氣管炎的潛在生物效應，根據設置閾值P<0.05篩選GO生物過程和KEGG通路。GO富集分析中，主要生物過程包括腺苷受體信號通路、嘌呤核苷酸分解過程等；細胞成分主要涉及細胞液，細胞連接，細胞內膜上細胞器等；分子功能主要涉及G蛋白偶聯腺苷受體活性、嘌呤核苷酸分解過程。KEGG通路富集分析結果顯示，靶點通路主要包括核受體轉錄途徑、色氨酸代謝、細胞色素P450對異生物質的代謝、花生四烯酸代謝、cAMP信號通路等(圖6～7)，這些通路直接或間接介導參與慢性支氣管炎的發生發展過程。結果表明，桿努盡煙主要化學成分的作用靶點涉及多樣化的生物學過程，并分布于不同的代謝通路，體現了其多成分、多靶點、多途徑的治療特點。為此，本研究結合富集分析結果及慢性支氣管炎發病機制，繪制桿努盡煙治療慢性支氣管炎分子作用機制的信號通路圖，主要包括NF-κB、TNF-α、cAMP、IL信號通路等，并選取了NF-κB、TNF-α通路關鍵靶點進行實驗驗證，見圖8。

圖6 關鍵靶點的GO富集

圖7 KEGG富集排名前15位的信號通路

圖8 桿努盡煙治療慢性支氣管炎分子作用機制圖

3.8 大鼠一般情況 正常對照組大鼠未見明顯癥狀；模型組大鼠毛發光澤度下降，體質量減輕，并伴有咳嗽、喘息等癥狀；與模型組大鼠比較，陽性藥物組、桿努盡煙各劑量組大鼠的一般情況均有改善，其中桿努盡煙高劑量組癥狀改善最為明顯。

3.9 大鼠肺組織病理學改變 正常對照組大鼠肺泡壁完整均一，細支氣管上皮細胞結構完整，排列整齊，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺泡壁結構完整性受到破壞，肺泡間和氣管旁有大量炎性細胞浸潤，細支氣管上皮細胞排列不整齊，管腔內可見明顯分泌物，提示炎性損傷發生，造模成功；與模型組比較，陽性藥物組大鼠肺泡壁及細支氣管周圍炎細胞浸潤程度減輕，桿努盡煙低劑量組大鼠炎性細胞浸潤程度較低，細支氣管上皮細胞有所改善，桿努盡煙高劑量組大鼠肺組織肺泡壁增厚情況得到改善，炎細胞浸潤程度減輕，管腔內分泌物減少，細支氣管上皮細胞排列整齊，見圖9。

3.10 桿努盡煙對大鼠肺組織中TNF-α水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組和桿努盡煙各劑量組大鼠組織中TNF-α水平均降低(P<0.05)，見表5。

表5 桿努盡煙對大鼠肺組織中TNF-α水平的影響

3.11 桿努盡煙對大鼠肺組織中NF-κB蛋白和mRNA表達的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中NF-κB蛋白和mRNA表達升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組和桿努盡煙各劑量組大鼠肺組織中NF-κB蛋白和mRNA表達均降低(P<0.05)，見圖10。

4 討論

本研究基于網絡藥理學方法挖掘苗藥桿努盡煙活性成分，獲得桿努盡煙活性成分5種，分別為3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸、1-(4-羥基-3-甲氧苯基)乙酮、石吊蘭素、熊果酸、β-谷甾醇，其中熊果酸、石吊蘭素、β-谷甾醇為“桿努盡煙-慢性支氣管炎靶點”網絡圖的核心節點，具有良好的抗炎、止咳等作用。

PPI網絡圖篩選出的關鍵靶點包括ALB、CYP1A1、CYP1B1等，“桿努盡煙-慢性支氣管炎靶點”網絡圖中ALOX5、ABCB1被預測為桿努盡煙治療慢性支氣管炎的靶點，其中ALOX5、CYP1B1、CYP1A2等靶點與炎癥密切相關，而炎癥反應作為慢性支氣管炎發展的核心機制，提示其可能參與桿努盡煙發揮治療慢性支氣管炎的作用過程。

圖9 各組大鼠肺組織切片

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖10 桿努盡煙對大鼠肺組織中NF-κB蛋白和mRNA表達的的影響

為進一步探究桿努盡煙治療慢性支氣管炎的作用機制，進行GO富集與KEGG分析，結果主要包括核受體轉錄途徑、色氨酸代謝、花生四烯酸代謝、細胞色素P450對異生物質的代謝等途徑。核受體超家族包括很多的轉錄因子，其中NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，能誘導腫瘤壞死因子受體1/2/4，白介素1等表達，在炎癥和免疫反應中發揮重要[11-12]。色氨酸作為人體必需的氨基酸，而5-羥色胺(5-HT)代謝途徑是其重要降解途徑，研究表明，5-HT的主要代謝物5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)與炎癥、氧化應激等多種免疫反應密切相關[13-14]。花生四烯酸(AA)代謝途徑活化會產生ALOX5、CYP1A1和CYP1B15等因子，進而激活TNF-α、IL-1等炎癥因子，刺激花生四烯酸分泌，促使炎癥反復發生[15-16]。由此可知，TNF-α、NF-κB參與色氨酸代謝、核受體轉錄途徑、花生四烯酸代謝等眾多生物過程，二者激活，可導致炎癥反應，進而加重慢性支氣管炎病情，提示桿努盡煙可通過調控TNF-α、NF-κB表達抑制炎癥反應，達到治療慢性支氣管炎的目的。

基于TNF-α、NF-κB靶點初步探究桿努盡煙治療慢性支氣管炎的作用機制，驗證網絡藥理學結果。采用煙熏加脂多糖氣管注射法成功建立慢性支氣管炎大鼠模型，給藥物28 d后，病理切片顯示桿努盡煙能減輕慢性支氣管炎大鼠肺組織炎癥；ELISA、RT-qPCR、Western blot結果提示桿努盡煙能降低大鼠肺組織勻漿中TNF-α、NF-κB表達，減緩炎癥反應。

綜上所述，本研究體現了桿努盡煙治療慢性支氣管炎多成分、多靶點、多途徑的作用特點，其可能通過抑制TNF-α、NF-κB表達，降低慢性支氣管炎肺部炎癥，進而發揮治療慢性支氣管炎的作用，為深入探究桿努盡煙治療慢性支氣管炎作用機制及其臨床運用提供理論依據。