中藥藥渣厭氧堆肥理化性質和酶活性的演變

劉 瑩，王明歡，王姍淇，張 英

(廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

近幾年我國中醫藥行業迅速發展，在中藥材加工炮制、中成藥的生產等過程中不免產生大量廢棄的中藥藥渣，每年中藥藥渣產量可達1 000萬噸[1]。目前，中藥藥渣的處理方式有焚燒、填埋、堆放等，不僅造成環境污染，而且由于藥渣中富含纖維素、半纖維素、木質素、蛋白質，大量植物生長所必需的微量元素及生物活性物質[2]，以上處置方式還造成了資源的浪費。

厭氧堆肥，也稱厭氧消化，能夠降解有機物實現有機固體廢棄物的減量化，消化后的殘渣是高質量的有機肥料和土壤改良劑[3-4]。目前更多運用于污水污泥以及生活垃圾等的減量化和清潔能源甲烷的生產[5-6]，在中藥藥渣的處理方面應用很少。本實驗以中藥藥渣為原料，通過研究厭氧堆肥過程中理化性質和酶活性的演變，探討環境因子對最終堆肥質量的影響，為中藥藥渣回收利用和厭氧堆肥處理有機固體廢物提供參考。

1 材料

1.1 堆肥材料 供試中藥藥渣取自廣州市某中成藥廠，羊糞取自某飼養場，秸稈生物炭購自河南立澤環保科技有限公司。堆肥材料性質見表1。

表1 堆肥材料的基本性質

1.2 儀器 FA2104型電子分析天平(上海明橋儀器設備有限公司)；DDB-12 L型筆式電導率儀(杭州齊威儀器有限公司)；YX-280型手提式壓力蒸汽滅菌器(合肥華泰醫療設備有限公司)；BPC-70F型生化培養箱、THZ-103B型恒溫培養搖床(上海一恒學儀器有限公司)；WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計[尤尼柯(上海)儀器有限公司]；AA7000型原子吸收分光光度計(日本島津公司)；1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；TGL-16A型離心機(湖南平凡科技有限公司)；DFD-700型水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)；SX2-2.5-10型馬弗爐(紹興蘇珀儀器有限公司)；HH-S1型油浴鍋(常州澳華儀器有限公司)。

2 方法

2.1 堆肥樣品制備 將新鮮中藥藥渣切成長度約為1 cm的小塊，新鮮羊糞過10目篩。以1.32∶1(干重)的比例將藥渣和羊糞混合，調節碳氮比(C/N)比至25，加入質量占藥渣和羊糞總干重5%的生物炭，總體C/N比不超過30，用純水調整含水量至65%，混合均勻，堆肥材料初始總質量約為20 kg。

將堆肥材料置于密封的加厚透明塑料袋中，從中引出一根導氣管，導氣管末端通入裝有水的燒杯，整個發酵用塑料袋置于90 cm×60 cm×40 cm封閉泡沫箱，控制環境溫度(19±1)℃，于堆肥第0、3、7、14、21、28、35、42天取樣，每次取樣350 g，于-20 ℃保存(必要時于保存于-80 ℃)。每次取樣前將堆體混勻，取樣后放入4個厭氧袋，以排除進入裝置的氧氣。

2.2 分析方法

將新鮮堆肥樣品在105 ℃的條件下烘干8 h以上，用于測定TOC、TOM、總養分、TN、WSN、TP、OP、TK和AK。TOC采用重鉻酸鉀容量法測定[7]，其中TOM含量用TOC含量乘以Van Benmmelen因數(1.724)表示；采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ 636-2012)測定TN和WSN；TP采用土壤全磷測定法(GB 9837-88)測定；OP采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法(HJ 704-2014)測定；TK采用土壤全鉀測定法(GB 9836-88)；AK采用土壤速效鉀測定法(DB13/T 844-2007)測定；總養分以TN、TP(P2O5)、TK(K2O)的含量之和計算，以數量百分數計(NY/T 2596-2014)。

風干堆肥樣品用于測定酶活性。蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法[9]測定，以1 d后1 g風干堆肥樣品水解生成葡萄糖的毫克數表示(mg·g-1·d-1)；脲酶活性采用苯酚-次氯酸鈉比色法[10]測定，以12 h后1 g風干堆肥樣品中NH3-N的毫克數表示(mg·g-1·12 h-1)；磷酸酶活性的測定參考《Methods of Soil Enzymology》[11]中的方法，以1 h后生成對硝基苯酚的毫克數表示(mg·g-1·h-1)；過氧化氫酶活性的測定參考文獻[12]，以20 min內1 g風干堆肥樣品消耗的H2O2的毫克數表示(mg·g-1·20 min-1)。

2.3 統計學分析 采用Origin 2018軟件進行數據繪圖，采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 理化指標的變化

3.1.1 pH值、VFAs和EC pH值是堆肥過程中的重要影響因素，pH值的變化直接影響堆肥過程及產物。過高的pH會使氨氣揮發，有機氮損失，pH值過低，會抑制微生物的活動，散發酸性氣味[13-14]，故通過在堆肥初始物料中添加5%的秸稈生物炭，使得初始pH值達到6.31。pH值變化見圖1，堆肥整體pH值呈下降趨勢，中間穩定在4.5，后期達4.6并呈略微上升趨勢。

圖1 pH值變化情況

揮發性脂肪酸(VFAs)是厭氧堆肥過程中的中間產物。其中乙酸作為主要的有機酸之一，其濃度堆肥初期呈上升趨勢，中期平穩，后期略呈下降趨勢，有機酸的變化與pH值相對應，見圖2。厭氧環境中，厭氧微生物分解藥渣中水溶性多糖，產生大量有機酸，導致pH降低，另一方面，相比于高溫或中溫厭氧堆肥，常溫厭氧堆肥中微生物活躍程度明顯較低[5]。由于本實驗在冬季進行，要保持高溫或中溫環境，能耗較高，所以厭氧堆肥對季節有一定的要求。

圖2 VFAs濃度變化情況

EC表示堆肥過程中可溶性鹽的變化，在一定濃度范圍內，與堆肥產品的鹽濃度呈正相關[15]。EC在堆肥過程中總體呈上升趨勢，后期穩定在2 800 μS/cm，見圖3。EC逐漸升高可能是微生物降解有機物產生鹽類物質的結果，當EC<4 000 μS/cm時，表示堆肥產品無毒[16]，整個厭氧堆肥過程中EC值都保持在4 000 μS/cm以下。

圖3 EC變化情況

3.1.2 E4/E6堆肥是有機質逐漸腐殖化的過程，腐殖酸類物質在465 nm和665 nm下存在特異吸收，兩者吸光度的比值可用來表示腐殖化程度。在堆肥過程中有機物不斷降解，不穩定的小分子物質向大分子物質轉化，小分子腐殖酸不斷轉化成大分子腐殖酸，E4/E6通常與腐殖酸的分子量和芳香環縮合度成反比[17]。在好氧堆肥過程中，通常隨著堆肥物料的腐熟程度升高而降低[18]，厭氧堆肥E4/E6的變化卻很少有人報道。本實驗E4/E6的變化見圖4，呈先下降后上升的趨勢，這與秦莉等[19]研究結果相似，其堆肥水提液的E4/E6值隨堆肥的進行總體呈上升趨勢。

圖4 E4/E6變化情況

3.1.3 TOC 堆肥物料中碳素物質是供微生物活動的碳源和能源[20]，中藥藥渣厭氧堆肥中TOC的變化，前期下降幅度較大，后期趨于穩定，這可能是由于在堆肥過程中微生物先利用易降解的物質如可溶性糖等進行新陳代謝，產生低分子有機酸等，然后開始分解一些難降解的物質，降解速率變緩并趨于平穩，見圖5。

圖5 TOC變化情況

3.1.4 C/N 碳和氮是微生物生長繁殖最重要的兩種營養物質，堆肥微生物在利用可降解的碳源的同時，還會利用部分氮素來構建自身細胞體，氮還是構成細胞中蛋白質、核酸、氨基酸、酶、輔酶的重要成分。C/N比是評估堆肥腐熟度最常用參數之一[21]。堆肥初期，C/N急劇下降，后趨于平穩，結束時降至18.93，低于堆肥成熟度的指標20，見圖6。

圖6 C/N變化情況

圖7 TN變化情況

水溶性氮(WSN)是可供植物直接吸收利用的速效氮[23]，本實驗中WSN含量于前2周呈下降趨勢，隨后上升，堆肥開始和結束時含量基本保持在3.5 mg/g，見圖8。

圖8 WSN變化情況

圖變化情況

3.1.6 TP、OP、TK和AK 總磷(TP)和有效磷(OP)含量在厭氧堆肥保持相似變化趨勢，小范圍上下波動，見圖10。結束時兩者含量為2.859、1.173 mg/g，略高于初始含量2.827、1.135 mg/g。

圖10 TP、OP變化情況

總鉀(TK)和有效鉀(AK)含量在此實驗過程中呈小范圍波動，堆肥前后含量基本不變，見圖11。

圖11 TK、AK變化情況

3.2 酶活性變化 堆肥過程中，有機質被微生物水解轉換成大量低分子有機酸，并在腐熟過程中形成穩定的腐殖酸類物質[26]，故參與反應的酶主要分為水解酶和氧化還原酶，本實驗主要考察蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶的活性變化，其中前三者屬于水解酶，直接影響堆肥礦質化過程的進程和強度，堆肥有機物中某些特定的底物需要用與該種底物相應的水解酶來催化降解[27]，過氧化氫酶屬氧化還原酶，對合成新的穩定的化合物起到催化作用，其變化在一定程度上反映堆肥腐殖化的進程和強度[28]。

厭氧堆肥過程中蔗糖酶活性逐漸上升，穩定在較高水平，脲酶和磷酸酶活性隨堆肥時間逐漸下降，最后趨于穩定，反映了藥渣堆肥中纖維素、多糖等有機質的降解轉化逐漸變緩。由于堆肥原料中藥藥渣中有機物含量高，堆肥前期有機物礦化，導致低分子有機酸積累，影響腐熟過程中腐殖酸的形成[29]，過氧化氫酶作為腐熟過程中的合成新的穩定化合物的催化酶，其活性于前4周隨低分子有機酸的積累逐漸下降，第5～6周隨堆體pH值的小幅度升高而略上升，見圖12。

3.3 理化、生化指標相關性分析 厭氧堆肥腐熟度受多方面因素的影響，單個指標的演變只能片面反應厭氧堆肥的過程，因此，對所測定的理化指標與生物特性進行簡單相關性分析，以探討環境因子對堆肥過程的影響。

相關性分析見表2，pH與C/N比呈極顯著正相關(R=0.883)，與VFAs呈極顯著負相關(R=-0.800)，與TOC呈顯著正相關(R=0.767)，與蔗糖酶活性呈顯著負相關(R=-0.767)，與酸性磷酸酶活性呈顯著正相關(R=0.783)，與過氧化氫酶呈極顯著正相關(R=0.967)。在該研究條件下，pH與VFAs、有機質的降解和酶活性存在顯著相關性。隨著堆肥的進行，即使NH4+-N呈逐漸上升趨勢，但水解過程中出現低分子有機酸的積累現象，VFAs濃度相對較高，pH降低，區別于其他研究中報道的pH與C/N比呈負相關[30]。

4 結論

中藥藥渣經長達42 d的常溫固態厭氧堆肥，總有機碳降解了47.015 mg/g，最終有機質含量>30%，符合《中華人民共和國農業行業標準(NY/T 2596-2014)》中有機質含量標準(30%)；堆肥最終總養分為41.382 mg/g，其比重為4.138%(以干基計)，略低于《中華人民共和國農業行業標準(NY/T 2596-2014)》中規定的沼肥總養分含量(5%)。在堆肥初期，N素含量逐漸升高，后又下降，如何降低N素損失以提高總養分是今后的研究重點。

中藥藥渣固態厭氧堆肥過程中，pH受多個理化指標的影響，表現在有機質的降解、酶活性等方面；蔗糖酶對于藥渣中有機質的降解起到重要作用，堆肥過程中存在有機酸積累現象，導致過氧化氫酶活性受到抑制，進而影響腐殖化進程。因此，在整個堆肥過程中pH的調控對于提高藥渣厭氧堆肥效果至關重要，本實驗通過于堆肥初始材料中添加秸稈生物炭調整初始pH，但添加生物炭的種類和比例對改善中藥藥渣厭氧堆肥效果有待進一步研究。

圖12 酶活性變化情況

表2 堆肥生物特性與理化因子之間的簡單相關性分析