人參的益生菌發酵及其發酵產品研究進展

張倩，國立東，都曉偉

(黑龍江中醫藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱，150040)

據2020版《中國藥典》(ISBN 978-7-5214-1574-2，Ⅰ部 人參)記載中藥人參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根及根莖，性甘，味微苦、微溫，歸脾、肺、心、腎經，具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養血、安神益智的功效。人參含有皂苷、多糖及揮發油等多種成分，人參皂苷是其主要活性物質。現代藥理研究證明人參皂苷能夠抗氧化、抗炎、抗菌、抗心血管疾病、抗糖尿病、抗癌、降低肥胖、提高精力與性耐力[1]。目前在人參中已發現40余種單體皂苷成分，其中人參皂苷Ra1、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1的含量占比超過95%，這些含量較高的人參皂苷經過水解可得到Rg3、Rh1、Rh2和CK等稀有人參皂苷[2]，部分皂苷的結構及轉化途徑詳見圖1、圖2[3-4]。相較于常見的人參皂苷，稀有人參皂苷表現出更強的生物活性，但在人參中天然產生的稀有皂苷含量低，難以滿足工業化生產和市場產品的需求。微生物發酵可使中藥有效成分的含量發生變化，甚至產生一些新的具有活性的次級代謝產物[5]。

圖1 部分人參皂苷的化學結構Fig.1 Chemical structure of some ginsenosides注：Glc：β-D-glucopyranosyl；Ara(p)：α-L-arabinopyranosyl；Ara(f)：α-L-arabinofuranosyl；Rha：α-L-rhamnopyranosyl

益生菌是一類對宿主有益的微生物，廣泛存在于人體腸道與生殖系統中，可調節宿主黏膜與免疫系統的功能、改善腸道菌群的平衡。益生菌種類繁多，可用于食品領域的菌種包括雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬等細菌，以及釀酒酵母、紅曲霉、靈芝等真菌[6]。近年來，采用益生菌對人參進行發酵的相關研究較多，利用益生菌發酵轉化人參中的皂苷類成分，不僅特異性強，產率高，并且安全性較高，已經成為提高人參產品生物活性的重要途徑之一[5]。本文分析總結不同種類的益生菌對人參的發酵研究進展情況，以期為稀有人參皂苷的高效轉化及人參發酵產品的開發提供參考。

a-二醇型人參皂苷轉化機理；b-三醇型人參皂苷轉化機理圖2 部分人參皂苷的轉化路徑Fig.2 Transformation pathway of some ginsenosides

1 益生菌發酵人參研究概況

1.1 乳酸菌與人參發酵

乳酸菌是人們熟知的益生菌，具有調節胃腸道菌群，改善胃腸道功能的作用，廣泛用于食品等領域。經研究發現，乳酸菌可產生淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶等多種酶類，相關研究人員從泡菜、酸奶、水果等食品中分離篩選出發酵乳桿菌、植物乳桿菌等菌株，無論是對常見人參皂苷還是稀有人參皂苷均有較好的轉化能力。劉濤[3]用植物乳桿菌發酵人參，發酵后人參皂苷Rh1、F2、Rg3和CK分別增加18.48%、135.73%、343.03%、441.80%，發酵液抗氧化能力增強，·OH、DPPH自由基、·O2-清除率分別提高11.75%、15.98%、9.07%。稀有皂苷Rh2、Rg3、CK具有良好的抗腫瘤的效果，人參經鼠李糖乳桿菌發酵后，Rh2、Rg3、CK增長9%、3.21%、12.98%，對肝癌細胞HepG2的抑制率最高增長8.9%[4]。QU等[7]采用發酵乳桿菌發酵人參，Rb1、Rc、Rd、Re、Rg1分別增長72.85%、33.99%、64.91%、63.55%、71.87%，0.5 g/(kg·d)發酵人參能有效恢復大鼠的腸道微生物菌群，緩解抗生素相關性腹瀉及結腸炎癥狀，降低免疫因子Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)和核因子κB在結腸中的表達。不同乳酸菌生物轉化人參有效成分的能力，如表1所示。

表1 乳酸菌生物轉化人參有效成分的能力Table 1 Ability of lactic acid bacteria to biotransform active ingredients of ginseng

續表1

在生物轉化過程中，菌種及菌株的種類差異會影響次級代謝產物的轉化類型及轉化效果，鼠李糖乳桿菌、腸膜明串珠菌、德式乳桿菌雖有轉化稀有人參皂苷Rh2、Rg3、Rg5、Rf的潛力，但轉化效果并不理想；發酵乳桿菌能夠顯著提高Rb1、Rc、Rd、Rg1等常見人參皂苷的含量，轉化率能夠達到30%～75%，而對稀有人參皂苷的轉化有待于進一步的研究；植物乳桿菌是研究最多的菌種，具有較強的轉化稀有人參皂苷Rg2、Rg3、Rh1、F2、CK的能力，對Rg2、F2的轉化率能夠達到170%以上，Rg3、Rh1、CK的轉化率能夠達到325%以上。植物乳桿菌轉化人參皂苷擁有極廣闊的研究空間，但因其菌株的多樣性導致皂苷的轉化結果差異明顯，所以在發酵過程中篩選出一株高效的乳酸菌菌株至關重要。

1.2 芽孢桿菌與人參發酵

芽孢桿菌在人參發酵上的應用研究報道不多，已報道的菌種有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)和多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。多粘類芽孢桿菌具有提高Rg1、Re、Rf、Rd等皂苷含量[15]的能力，但受其安全性的限制，大多應用于生物防治方面。枯草芽孢桿菌與凝結芽孢桿菌是能夠用于食品的益生菌，趙彩秀等[16]采用枯草芽孢桿菌JLGA-SD-28發酵人參實現Rb1→Rg3→Rk1/Rg5的轉化，然后通過全基因組測序分析得出有62個基因與Rg3的轉化有關，46個基因與Rk1、Rg5的轉化有關，為后續轉化機制及酶學研究提供依據。在大醬中篩選出β-葡萄糖苷酶活性較強的枯草芽孢桿菌，對人參進行固態發酵，雙螺桿擠壓后的人參和白參Rg3含量分別提高70.99%、53.75%[17]。人參豆豉發酵物在枯草芽孢桿菌的發酵作用下，人參皂苷Rk1、F2、Rh4、Rd、Rg3增長率高達142.29%、228.31%、189.41%、718.15%、499.90%[18]。王國明[19]采用凝結芽孢桿菌發酵人參，生成稀有皂苷CK，產量為12.11 mg/g，推測其機制為Rb3/Rd→CK，且CK能顯著降低急性腎損傷小鼠血清中尿素氮、肌酐水平，改善受損腎臟組織形態，升高腎臟組織中超氧化物歧化酶和還原性谷胱甘肽活性并降低丙二醛含量從而保護小鼠急性腎損傷。相較于乳酸菌，已報道的芽孢桿菌轉化的皂苷類型有限，但對稀有皂苷的轉化率更高，然而其轉化機制尚不清楚。因此，有必要對乳酸菌與芽孢桿菌轉化人參進行系統的比較分析，闡明二者在轉化人參皂苷機制上的差異，從而為指導人參皂苷的生物轉化及其產品開發奠定理論基礎。

1.3 酵母菌與人參發酵

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)是符合食品安全標準的菌株，釀酒酵母可以提高人參皂苷Rb1、Re、Rg1的含量[20]，也能將固有人參皂苷轉化為稀有皂苷Rg3[21]。蘇敏等[21]從開菲爾(Kefir)粒中篩選出能夠產生β-葡萄糖苷酶的馬克思克魯維酵母，經發酵，Rg3的轉化率高達248%。然而與乳酸菌、芽孢桿菌相比，酵母菌的轉化能力有限，賈翠英等[22]首次采用海藻酸鈉包埋酵母菌的方式進行發酵，與未包埋酵母菌轉化人參相比，不僅使Rb1的轉化率提高了3%～5%，而且簡化了菌種活化步驟以及便于將發酵生產自動化，為提高酵母菌的發酵效率提供一種新的方法。另外，工程酵母菌在人參發酵方面應用廣泛，LIANG等[23]從枯草芽孢桿菌中鑒定出UGT109A1，用以構建工程酵母菌，能夠產生比Rg3抗肺癌活性更強的非天然人參皂苷3β,12β-Di-O-Glc-PPD，產量為9.05 mg/L。工程酵母菌也能夠實現人參皂苷的逆向轉化，從人參中分離鑒定出對原人參二醇型皂苷(protopanaxadiol, PPD)活性較強的葡萄糖醛酸基轉移酶(UDP-glycosyltransferases, UGT)——UGTPg45、UGTPg29，能分別在PPD與Rh2的C3—OH位添加葡萄糖，實現PPD→Rh2→Rg3的轉化，Rh2與Rg3的生成量分別為1.45、3.49 μmol/g[24]。WEI等[25]也在人參中分離出對原人參三醇型皂苷(protopanaxatriol,PPT)有較強活性的UGTPg1、UGTPg100、UGTPg101，用其構建工程酵母菌，能夠實現PPT→F1/Rh1，F1和Rh1產率高達42.1、92.8 mg/L。與天然酵母菌相比，工程酵母菌轉化人參皂苷具有更廣闊的研究前景，不僅能實現天然皂苷的生物轉化，也能產生新的產物，為酵母菌轉化人參的規模化生產提供有效途徑。

1.4 紅曲霉與人參發酵

曲霉菌在中藥發酵領域應用廣泛，其中黑曲霉(Aspergillusniger)因能產生活性較強的葡萄糖苷酶、果膠酶、纖維素酶等酶而被廣泛使用。經過黑曲霉發酵，能夠實現Rb1→F2/CK的轉化，其中CK與F2的轉化率能夠達到85%、50%[26]。黑曲霉的轉化效率較高，但目前尚未列入國家益生菌的使用范疇，故在食品方面的應用受到限制。紅曲霉(Monacusanka)在中藥發酵方面雖不及黑曲霉應用廣泛，但是它為藥食兩用的真菌，在食品研究與開發方面具有較大的潛力。人參經紅曲霉發酵后Rb1、Rb2、Rc含量減少，Rg3質量分數增加了40%，達到6.047 mg/g，推斷Rg3的轉化路徑為人參皂苷Rb1/Rb2→Rd→Rg3[27]。厙守權等[28]還在人參的紅曲霉發酵產物中檢測出具降低膽固醇作用的monacolin K，發酵產物兼具人參和紅曲霉主要活性物質，極大提高了兩者的生物利用價值。

1.5 大型食藥用真菌與人參發酵

靈芝(Ganodermalucidum)和冬蟲夏草(Cordycepssinensis)是名貴中草藥，也是大型食藥用真菌。從新鮮的冬蟲夏草中分離出的叢梗孢科瓶梗青霉屬蟲生真菌蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyceshepiali)與冬蟲夏草有效成分類似，已作為冬蟲夏草的代用品在中成藥和保健食品中廣泛使用。靈芝菌與人參共發酵能夠顯著提高Rg5[29]、Rf[29]、Rg3[30]、Rh1[30]等稀有皂苷的含量，轉化率高達601.24%、166.02%、238.91%、408.88%，與乳酸菌、芽孢桿菌相比，其轉化效率較高，并且能夠轉化2種細菌不能生成的稀有皂苷Rg6和F4[29]，同時，經發酵所得的藥性菌質抗氧化活性提高[29]，對肝癌細胞SMMC—7721抑制能力增強[30]，且提高巨噬細胞吞噬指數、淋巴細胞轉化率及血清溶血素水平從而增強機體的免疫功能[31]。這些大型食藥用真菌生物轉化人參有效成分的能力，詳見表2。在發酵過程中，食藥用真菌產生的糖苷酶能夠水解皂苷側鏈上的糖基對皂苷進行結構修飾，實現稀有皂苷的轉化；人參中的多糖、氨基酸、微量元素也為真菌菌絲的生長提供豐富的碳源、氮源，促進靈芝多糖、腺苷等有效成分的富集。因此，雙向發酵不僅使人參皂苷的含量有所改變，真菌中的活性成分也會提高，起到真菌與人參雙向發酵協同增效的作用[32]。

表2 大型食藥用真菌生物轉化人參有效成分的能力Table 2 Ability of edible and medicinal fungi to biotransform active ingredients of ginseng

1.6 復合菌株與人參發酵

采用單一菌株對人參發酵取得了可觀的成果，但不同微生物所含有的酶系具有差異性，在自然界中，植物的生長發育是多種微生物相互作用的結果，采用復合菌株進行發酵，可以使反應過程中酶系多樣化與互補，使中藥組織中的有效成分或營養物質得到充分的分解、溶出和利用，提高中藥的生物利用率。嗜酸乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌∶干酪乳桿菌按照1∶1∶1的體積比發酵人參，轉化生成皂苷元PPD、PPT能力更強，生成量占總皂苷成分的22.15%，與人參皂苷Rh1、CK共占總皂苷的33.42%[2]。應用組合菌釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、枯草芽孢桿菌發酵人參可以提高稀有皂苷Rh1、F2、Rg3、C.Y的含量，轉化率最高可達127.3%、63.5%、255.8%、226.6%[34]。然而，薛兢兢等[35]在乳桿菌與復合菌(乳桿菌+酵母菌)發酵對比研究中發現單一菌株發酵更勝一籌，分析乳桿菌與酵母菌在生長過程中產生競爭性抑制，限制對方發揮最大潛力。因此，在優選復合菌株的過程中，菌株之間的拮抗作用也是較為重要的考察因素。復合菌株與單一菌株相比有很大的轉化優勢，目前的研究大多用不同乳酸菌搭配進行發酵，乳酸菌與芽孢桿菌等菌株的復合搭配鮮有報道，對其生物轉化及轉化機制有待于深入研究。

2 益生菌發酵轉化人參皂苷生物學機制

稀有人參皂苷與常量皂苷相比母核相同，只是C3、C6、C20糖基的類型或數目不同，從而表現出更強的抗腫瘤、心血管保護等生物活性。益生菌發酵過程中產生的β-葡萄糖苷酶、β-阿拉伯呋喃糖苷酶等能夠特異性水解C3、C6、C20的糖基從而實現稀有皂苷的生物轉化[5]。益生菌種類不同，酶系的種類與活性也有所差異，糖苷酶依據連接位置、殘基、酶活性分為四類：Ⅰ型糖苷酶能同時水解PPD C3和C20連接的糖基;Ⅱ型糖苷酶能水解PPD或PPT C20位連接的糖基;Ⅲ型糖苷酶能水解PPD C3位外側連接的葡萄糖;Ⅳ型糖苷酶能水解PPT C6位連接的糖基[36]。β-葡萄糖苷酶作為益生菌中的常見酶，是目前的研究熱點。QUAN等[13]從泡菜中篩選出產β-葡萄糖苷酶的LactobacillusparalimentariusLH4，能夠水解C3、C20位的2個葡萄糖基，實現Rb1→絞股藍皂苷XVII/Rd→F2→CK的轉化。干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和發酵乳桿菌5種乳酸菌中植物乳桿菌的β-葡萄糖苷酶活性最強，可以水解C3、C20位的糖基實現原人參二醇型皂苷Rb1/Rb2→Rd→F2→CK和Rb1→Rd→Rg3的轉化[3]。同樣在鼠李糖乳桿菌β-葡萄糖苷酶的作用下，原人參三醇型皂苷Re的C6、C20位分別脫去一分子鼠李糖和葡萄糖生成Rh1，Rh1脫去C6位的一分子葡萄糖生成PPT[4]。枯草芽孢桿菌也具有產生β-葡萄糖苷酶的能力，皂苷轉化機制可能為 Rb1的C20位糖苷鍵水解斷裂生成Rg3，Rg3的C20位發生脫水反應生成Rk1和Rg5[16]。糖苷酶的生物來源不同，其作用的位點不同，轉化效果也具有差異性。不同糖苷酶的聯合應用對稀有皂苷的轉化會產生積極的影響，有望成為未來一個熱門的研究方向。

3 人參發酵產品研究概況

3.1 國內人參發酵食品

2011年之前，人參在我國只作為藥物進行銷售，在一定程度上限制了人參的市場消費，2012年，國家衛生部第17號文件根據《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理辦法》批準將人參(人工種植)列為新資源食品(2013年修訂為新食品原料)，以人參為原料的食品相繼出現。迄今為止，已有1 008種人參保健品上市，涵蓋膠囊(48.68%)、口服液(14.61%)、酒(14.21%)、片(9.17%)、顆粒(3.83%)、茶(2.72%)、丸(2.11%)、飲料(1.31%)、沖劑(1.01%)、粉(0.91%)、膏(0.91%)、漿(0.5%)等多種劑型，而人參發酵型產品種類較少，僅包含人參發酵酒、人參發酵果蔬飲品、人參發酵蜜片等，目前處于實驗階段的人參山楂咀嚼片等新型產品的開發將會充分發揮人參的保健價值[37]。

3.1.1 單味人參發酵食品

Kefir粒是人參發酵食品中使用較多的發酵劑之一，它是由乳酸菌、醋酸菌、酵母菌等多種益生菌組成的復合菌，菌群之間存在良好的共生關系。Kefir粒有氧發酵人參，可以產生烷烴類、萜烯類、芳香類等64種香氣成分，發酵物有草藥味和燒烤香味[38]。白鈺[39]分別采用人參花、Kefir粒發酵，制備出口感良好的人參花飲品。靈芝具有滋補強身的功效，廣泛用于食品領域。林琳[31]采用人參與靈芝復合發酵制備的參芝發酵飲品，顏色飽滿清澈，菌球口感順滑，具人參特異香氣，并且該飲品既能發揮靈芝提高免疫力的作用，也能發揮人參抗疲勞的作用。

3.1.2 人參復方發酵食品

在以Kefir粒為發酵劑、人參為原料的基礎上，分別添加乳清、枸杞、大米糖化液、山楂制得人參乳清飲品[40]、人參枸杞發酵飲品[41]、人參米酒[42]和人參山楂咀嚼片[38]，產品酸甜可口、口感細膩、有人參的芳香氣味。在酸奶中加入人參，具有更高的營養價值。王銀平[43]優化人參酸奶的發酵工藝，在混合菌種(嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、德式乳桿菌保加利亞亞種)、超微人參粉、白砂糖、果膠添加量分別為0.006%、0.6%、7%、0.2%的條件下，制得的酸奶口感最好，價值較高。采用植物乳桿菌，輔以檸檬汁、棗汁、蜂蜜制備的人參口服液清爽可口、酸甜適中[44]。用人參為原料開發的發酵酒憑借獨特的口感和保健功效在中國市場備受歡迎。喬夢丹等[45]優化人參-仙人掌果酒的發酵工藝，在酵母接種量1‰、發酵溫度24 ℃、pH 4.0的條件下，人參總皂苷、花青素分別達到0.937 6、0.106 6 mg/mL。近年來，生物轉化技術日漸成熟，乳酸菌、靈芝菌、酵母菌等在人參食品中有了更多應用，人參發酵產品成為新的研發方向(表3)。

表3 人參發酵食品研究概況Table 3 Research on ginseng fermented food

3.2 韓國人參發酵食品

韓國的人參產品種類豐富，經研究開發的人參飲料、人參糖、人參茶、人參餅干、人參方便面、人參果醬、人參蜜片等憑其獨特的口感和保健作用深受消費者青睞[48]。韓國的發酵技術較為成熟，人參(紅參)發酵產品在酸奶、奶酪兩大方面研究頗多。乳桿菌屬菌種和嗜熱鏈球菌是常用的酸奶發酵劑，將牛奶、2%脫脂乳、0.1%果膠混合，加入不同劑量的人參粉，接種植物乳桿菌NK181與嗜熱鏈球菌(1∶1)在40 ℃發酵至pH 4.4～4.5，制得人參酸奶成品口感良好，且隨著人參量的增加，產品的抗氧化能力逐漸增強，增長率最高可達37.32%[49]。LEE等[50]分別采用土壤栽培人參與水培人參進行人參酸奶的研制，將牛奶、脫脂乳與2種人參提取液混合，接種0.1%的商業化乳酸菌發酵劑在40 ℃下發酵至pH 4.5，冷藏24 h即得成品，其中水培人參發酵酸奶口感良好，抗氧化能力為土壤栽培人參的2倍，水培人參應用于維持人體健康的高價值乳制品有較大的前景。發酵奶酪的制作是往牛奶中加入不同濃度的人參，在35 ℃下經商業化乳酸菌發酵劑發酵220 min，再加入0.2 mL/L凝乳酶，4 ℃靜置混凝19 h得到人參奶酪。通過添加人參提取物，奶酪的脂肪和蛋白質水平升高，隨著人參濃度的增加，奶酪的硬度和黏度提高，但人參的苦味也越來越顯著[51]。制作紅參奶酪時可以通過添加氨基酸-發酵紅參凝析液改善紅參所帶來的苦味[52]。人參作為一種天然植物補充劑，在國際上占有成熟的市場。隨著人們保健意識的增強，更多人參功能性產品出現在公眾視野。

4 結論與展望

益生菌發酵人參已成為目前的研究熱點，益生菌的發酵過程實質是酶的作用，不同類型的益生菌經過自身代謝產生的糖苷酶，能夠特異性地作用于人參皂苷的不同位點，通過水解糖基實現不同皂苷的定向轉化，提高稀有皂苷等有效成分的含量，增強產物的藥理活性，豐富營養結構，改善口感風味，對人參功能性產品的研發具有切實的研究價值。然而，目前在稀有皂苷的靶向轉化研究中涉及的皂苷種類較少，有待于篩選益生菌、糖苷酶的類型或通過構建工程酵母菌等手段實現其他皂苷的定向轉化。發酵人參的飲品開發雖取得了一定的成果，但形式過于單一，新產品的創制也是未來的研發方向，且相關產品需要從體外試驗、動物試驗、人體臨床試驗3個方面進行耐藥性、代謝活性等研究，從而建立科學、全面的安全性評價方法。