扁蒴藤素對人結直腸癌細胞HCT116和HT29增殖、遷移和細胞周期的影響及作用機制研究

呂蒙瑩, 羅照勇, 王維民, 梁巧玲,王 楊, 錢亞云, 劉延慶

(1. 揚州大學醫學院/轉化醫學研究院, 江蘇 揚州, 225001;2. 國家中醫藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室, 江蘇 揚州, 225001)

結直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一, 發病率和病死率在全球分別位居惡性腫瘤的第3位和第2位[1], 其臨床治療方法以手術為主, 且術后輔以放化療。近年來，隨著靶向生物制劑的使用，結直腸癌的治療取得了重要進展，但轉移性結直腸癌仍然是治療的難點，約35%結直腸癌患者在初次診斷時已進入轉移期，而多達50%的非轉移性結直腸癌最終也會進展為轉移性結直腸癌[2]。目前, 5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑和伊立替康等藥物仍然是結直腸癌的主要化療用藥，但其毒副作用往往導致患者治療依從性較差[3]。因此，從中草藥中探尋治療效果好且副作用低的活性成分已成為當前研究的熱點。扁蒴藤素作為一種天然的三萜類化合物，在自然界中主要分布于衛矛科和翅子藤科植物中，具有抗癌、消炎、殺菌、抗瘧等藥理作用[4]。已有研究[5]表明，扁蒴藤素主要通過抑制生長，誘導自噬和凋亡，抑制侵襲、遷移和血管生成，逆轉耐藥和協同化療藥物等方式發揮體外抗腫瘤活性。扁蒴藤素對口腔癌[6]、結直腸癌[7]、乳腺癌[8]、肺癌[9]和前列腺癌[10]等多種腫瘤細胞具有抑制作用，但其分子機制尚未闡明。本研究探討扁蒴藤素對人結直腸癌細胞增殖、遷移和細胞周期的影響及其作用機制，以期為后續深入研究分子機制和治療靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細胞株: 人結直腸癌HCT116細胞和HT29細胞，購于武漢普諾賽科技有限公司。細胞以含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基于37 ℃、5%CO2條件下培養。

1.1.2 藥物與試劑: 扁蒴藤素(批號0476159-13, 純度≥98%)購自美國Cayman 化學公司, RPMI 1640培養基(貨號SH30 809.01)購自美國Hyclone公司，胎牛血清(貨號04-001-1ACS)購自以色列BI公司，噻唑藍(MTT)粉劑(貨號ST1537)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號P0012)購自上海碧云天生物公司。Transwell小室(貨號3422)購自美國Costar公司, 5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)試劑盒(貨號C10310)購自廣州銳博生物科技有限公司。兔抗人單克隆抗體GAPDH(貨號5174s)、p21(貨號2947)、p27(貨號2552)、p53(貨號2527T)、cyclin E1(貨號20808s)、CDK2(貨號2546s)、Akt(貨號4691T)、p-Akt(貨號4060T)、PI3K(貨號4292)、mTOR(貨號2983)、p-mTOR(貨號5536)均購自美國CST公司, p-PI3K(貨號abs130868)購自上海愛必信生物科技有限公司，山羊抗兔二抗(貨號FMS-Rb01)購自中國南京福麥斯公司。

1.1.3 儀器: 恒溫培養箱(美國Thermo公司)，蛋白電泳槽、全自動酶標儀、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)成像分析儀(美國Bio-Rad 公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗檢測細胞存活率: 將對數生長期的HCT116細胞和HT29細胞接種于96 孔板(5×103個/孔)，實驗分別設置對照組(不加藥物處理)、空白組(只含培養基)和藥物組(分別加入不同濃度扁蒴藤素)，每組均設置3個復孔。藥物組加入無血清培養基配置的不同濃度(0.5、1、2、4、8 μmol/L)扁蒴藤素孵育12、24、36、48、60 h后，每孔加入20 μL 0.5% MTT繼續培養 4 h。棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO), 于搖床上低速振蕩10 min, 用多功能酶標儀于490 nm處測量各孔吸光度(A)值。根據公式計算存活率，存活率=[1-(A對照組-A藥物組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

1.2.2 EdU實驗檢測細胞增殖: 將HCT116細胞和HT29細胞接種于24孔板(8×103個/孔)，實驗分別設置對照組和藥物組，每組均設置3個復孔。根據HCT116細胞、HT29細胞24 h半數抑制濃度(IC50)(0.85、2.89 μmol/L), HCT116細胞分別用0.5、1、2 μmol/L扁蒴藤素處理24 h, HT29細胞分別用1、2、4 μmol/L扁蒴藤素處理24 h。待細胞貼壁后，嚴格按照EdU試劑盒說明書操作，每孔加入100 μL含EdU探針的培養基(50 pmol/L), 37 ℃、5%CO2孵育2 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗, 4%多聚甲醛固定，每孔隨機選取5個視野于顯微鏡下分別計數視野下EdU探針標記的帶有紅色熒光的細胞和Hoechst 33342標記的帶有藍色熒光的細胞，每組實驗至少重復3次。陽性細胞率=EdU標記的細胞數/Hoechst 33342標記的細胞數×100%。

1.2.3 Transwell實驗檢測細胞遷移: 將對數生長期的HCT116細胞和HT29細胞于Transwell上層小室中接種(5×104個/孔)，向下層小室中加入600 μL培養基(含10%FBS), 上下層之間防止氣泡產生。2種細胞的實驗分別設置對照組和藥物組，每組均設置3個復孔。HCT116細胞分別用0.5、1、2 μmol/L扁蒴藤素處理24 h，HT29細胞分別用1、2、4 μmol/L扁蒴藤素處理24 h。將Transwell小室取出，用PBS清洗，用棉簽輕輕去除上室膜表面的細胞，于甲醇中進行固定，并用結晶紫進行染色, PBS清洗3遍。每孔隨機選取5個視野于倒置顯微鏡下進行拍照分析。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期: 將對數生長期HCT116細胞和HT29細胞經胰酶消化后，接種于直徑60 mm的培養皿中。HCT116細胞-對照組、HT29細胞-對照組細胞均不加藥物處理, HCT116細胞-扁蒴藤素組細胞以0.85 μmol/L扁蒴藤素處理，HT29細胞-扁蒴藤素組細胞以2.89 μmol/L 扁蒴藤素處理。24 h后，收集細胞至離心管內并進行固定，每管加入碘化丙啶(PI)染色液(500 μL)在37 ℃條件下避光孵育30 min后，使用流式細胞儀進行檢測，并應用FlowJo 7.6軟件進行細胞DNA含量分析。

1.2.5 蛋白質印跡法(Western blot)檢測蛋白表達: 將對數生長期的HCT116細胞和HT29細胞接種于直徑100 mm的培養皿中。待細胞貼壁后, HCT116細胞、HT29細胞的對照組均不加藥物處理, HCT116細胞的扁蒴藤素組以0.85 μmol/L扁蒴藤素處理, HT29細胞的扁蒴藤素組以2.89 μmol/L扁蒴藤素處理。24 h后提取細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白濃度測定。細胞總蛋白經蛋白變性后再進行SDS-PAGE, 然后電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下用TBST溶液(含有5%脫脂奶粉)封閉 2 h, 加入一抗(濃度1∶1 000), 放置于4 ℃搖床上孵育過夜，再用TBST清洗3遍，二抗(濃度1∶5 000)室溫孵育2 h, 應用電化學發光(ECL)系統檢測蛋白表達。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 扁蒴藤素對HCT116細胞和HT29細胞存活率的影響

12 h時, 1、2、4、8 μmol/L扁蒴藤素處理的HCT116細胞存活率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001); 24、36、48、60 h時，0.5、1、2、4、8 μmol/L扁蒴藤素處理的HCT116細胞存活率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001); 12 h時，2、4、8 μmol/L扁蒴藤素處理的HT29細胞存活率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001); 24 h時，1、2、4、8 μmol/L扁蒴藤素處理的HT29細胞存活率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001); 36、48、60 h時, 0.5、1、2、4、8 μmol/L扁蒴藤素處理的HT29細胞存活率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001), 見圖1。由此表明，扁蒴藤素對HCT116細胞和HT29細胞活力有明顯抑制作用，且呈時間和濃度依賴性。此外，扁蒴藤素對HCT116細胞作用24 h的IC50為0.85 μmol/L, 對HT29細胞作用24 h的IC50為2.89 μmol/L。

A: 不同濃度扁蒴藤素對HCT116細胞存活率的影響(與對照組比較 ,***P<0.001);B: 不同濃度扁蒴藤素對HT29細胞存活率的影響(與對照組比較, ***P<0.001)。圖1 MTT實驗檢測不同濃度扁蒴藤素對人結直腸癌細胞存活率的影響

2.2 扁蒴藤素對HCT116細胞和HT29細胞增殖的影響

EdU實驗(藍色熒光代表以Hoechst 33342標記的活細胞，紅色熒光代表以EdU標記的正在進行DNA復制的增殖細胞)結果顯示，經0.5、1、2 μmol/L扁蒴藤素處理24 h后, HCT116細胞中陽性細胞率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001); 經1、2、4 μmol/L扁蒴藤素處理24 h后，HT29細胞中陽性細胞率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001), 見圖2。由此表明，扁蒴藤素能夠抑制HCT116細胞和HT29細胞增殖，并具有濃度依賴性。

A: 不同濃度扁蒴藤素對HCT116細胞增殖的影響(與對照組比較, ***P<0.001); B: 不同濃度扁蒴藤素對HT29細胞增殖的影響(與對照組比較, ***P<0.001)。圖2 EdU實驗檢測不同濃度扁蒴藤素對人結直腸癌細胞增殖的影響

2.3 扁蒴藤素對HCT116細胞和HT29細胞遷移的影響

Transwell實驗結果顯示，加入0.5、1、2 μmol/L 扁蒴藤素作用24 h后, HCT116細胞穿透小室底膜的數量變少，且細胞遷移率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001); 加入1、2、4 μmol/L扁蒴藤素作用24 h后, HT29細胞穿透小室底膜的數量變少，且細胞遷移率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001), 見圖3。由此表明，扁蒴藤素能夠抑制HCT116細胞和HT29細胞遷移，且具有濃度依賴性。

A: 不同濃度扁蒴藤素對HCT116細胞遷移的影響(與對照組比較, ***P<0.001); B: 不同濃度扁蒴藤素對HT29細胞遷移的影響(與對照組比較, ***P<0.001)。圖3 Transwell實驗檢測不同濃度扁蒴藤素對人結直腸癌細胞遷移的影響

2.4 扁蒴藤素對HCT116細胞和HT29細胞周期的影響

流式細胞術結果顯示, HCT116-扁蒴藤素組、HT29-扁蒴藤素組處于G0/G1期的細胞百分比分別高于HCT116-對照組、HT29-對照組，差異有統計學意義(P<0.05), 說明扁蒴藤素可阻滯細胞周期于G0/G1期，見圖4。Western blot結果顯示, HCT116細胞、HT29細胞的扁蒴藤素組p53、p21、p27蛋白表達量均分別高于HCT116細胞、HT29細胞的對照組, cyclin E1、CDK2蛋白表達量均分別低于HCT116細胞、HT29細胞的對照組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001), 說明扁蒴藤素能夠上調人結直腸癌細胞周期蛋白p53、p21、p27表達并抑制cyclin E1、CDK2表達，見圖5。

A: HCT116-對照組細胞周期百分比; B: HCT116-扁蒴藤素組細胞周期百分比; C: HT29-對照組細胞周期百分比; D: HT29-扁蒴藤素組細胞周期百分比。圖4 流式細胞術檢測扁蒴藤素對HCT116細胞和HT29細胞周期的影響

A: 扁蒴藤素對HCT116細胞周期相關蛋白表達的影響(與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001); B: 扁蒴藤素對HT29細胞周期相關蛋白表達的影響(與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)。圖5 Western blot檢測扁蒴藤素對人結直腸癌細胞周期相關蛋白表達的影響

2.5 扁蒴藤素對PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路的影響

Western blot結果顯示, HCT116細胞、HT29細胞的扁蒴藤素組p-Akt、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白表達量均分別低于HCT116細胞、HT29細胞的對照組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001), 見圖6。由此提示，扁蒴藤素可能通過調控PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路發揮抑制HCT116細胞、HT29細胞增殖和遷移的作用。

A: 扁蒴藤素對HCT116細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響(與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001); B: 扁蒴藤素對HT29細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響(與對照組比較, **P<0.01, ***P<0.001)。圖6 Western blot檢測扁蒴藤素對人結直腸癌細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響

3 討 論

盡管結直腸癌治療方案眾多，如手術、放療、化療、靶向治療和基因治療等，但轉移性結直腸癌患者的5年總生存率仍僅維持在10%[11]。

結直腸癌早期(Ⅰ期和Ⅱ期)患者通常采用無輔助治療的標準結腸切除術(伴淋巴結切除術)進行治療，而晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)患者大多采用放化療進行治療，以降低復發風險，但大部分晚期患者都會發展為轉移性結直腸癌(主要轉移至肝臟)，這是目前結直腸癌治療中的難點[12]。化療藥物副作用較大，且價格昂貴，因此有必要從天然植物中尋找副作用小且價格低廉的新型抗腫瘤藥物。

結直腸癌屬中醫“積聚”“腸覃”“鎖肛痔”等范疇，其主要病機為七情內傷、飲食不節、肝腎虧虛以致外邪乘虛而入或毒邪積聚而內[13]。中醫理論將結直腸癌辨證分為脾虛濕毒、脾腎兩虛、肝腎陰虛、氣血虧虛和濕熱瘀毒5種類型[14]。扁蒴藤素是衛矛科南蛇藤屬植物的主要活性成分之一，該類植物主要特征為性辛溫，具有祛風除濕、行氣散血、消腫解毒的功效，故推測扁蒴藤素可能更適用于濕熱瘀毒型腫瘤。《素問·至真要大論》指出: “主病之謂君，佐君之謂臣，應臣之謂使。”君藥是中藥方劑中對疾病起主要治療作用的藥物[15], 扁蒴藤素作為一種天然的五環三萜類化合物，對多種腫瘤細胞均有明顯抑制作用，按照中藥方劑“君臣佐使”的思想，其或可行“君藥”之效。

本研究MTT實驗結果顯示, HT29細胞24 h的IC50值是HT116細胞的3倍以上，說明HCT116細胞相較于HT29細胞對扁蒴藤素更為敏感，但隨著藥物作用時間的延長, 2種細胞的細胞活力均受到顯著抑制; EdU實驗和Transwell實驗結果顯示, HCT116細胞的增殖和遷移能力均強于HT29細胞，但隨著扁蒴藤素濃度的增加，2種細胞的增殖和遷移均受到顯著抑制; 流式細胞術和Western blot結果表明，扁蒴藤素對HCT116細胞和HT29細胞的作用機制可能與調控細胞周期進程和影響PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路有關。鑒于扁蒴藤素可阻滯HCT116細胞和HT29細胞周期于G0/G1期，本研究進一步采用Western blot對關鍵的細胞周期調控因子如細胞周期蛋白(cyclin)、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDKs)和細胞周期依賴性蛋白激酶抑制物(CKIs)表達情況進行檢測[16]。CDK2的活性依賴于與cyclin E結合形成的cyclin E-CDK2復合物，可調控細胞周期中的G1/S期過渡[17]。本研究發現，扁蒴藤素能夠降低cyclin E1和CDK2的表達，使細胞周期不能進展到S期，而被阻滯在G0/G1期。p21和p27均屬于CKIs, 其中p21可被p53誘導轉錄，也可抑制cyclin E-CDK2蛋白復合物的活性，而p27可抑制CDK2的活性[18-19]。本研究結果顯示，扁蒴藤素能顯著上調p21、p27和p53蛋白表達，說明扁蒴藤素可通過調控cyclins/CDKs/CKIs網絡影響人結直腸癌細胞HCT116和HT29的細胞周期進程。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是人類癌癥中常見的信號通路之一，控制著許多關鍵的細胞過程，如生長、增殖、代謝和遷移等。Akt是這一信號級聯的關鍵效應分子，在細胞生長、增殖、存活和代謝中發揮關鍵作用[20]。PI3K的磷酸化可以修飾Akt的蛋白結構，進而激活Akt, 調控腫瘤細胞的增殖和遷移[21]。mTOR是PI3K/Akt通路的下游靶點, p-Akt可通過激活mTOR而調控細胞代謝，如抑制細胞增殖和信號轉導，參與腫瘤進程和化療耐藥，已有臨床研究[22-23]將靶向mTOR的抑制劑應用于腫瘤治療中，并發現具有PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制作用的天然產物具有重要意義。PI3K/Akt/mTOR失調與許多實體腫瘤的發展有關，相關研究[24-25]發現，抑制PI3K/Akt/mTOR通路能夠誘導胃癌和肝癌細胞G1期阻滯。此外，扁蒴藤素可通過降低PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白p-Akt、p-mTOR的表達而抑制骨肉瘤細胞的生長[26]。在葡萄膜黑色素瘤UM-1細胞中，扁蒴藤素可通過抑制PI3K/Akt/FoxO3a信號通路誘導細胞凋亡[27]。本研究Western blot結果顯示，扁蒴藤素能夠顯著降低HCT116細胞、HT29細胞中的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達水平，表明扁蒴藤素可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活而抑制HCT116細胞、HT29細胞的增殖和遷移。

綜上所述，扁蒴藤素能夠抑制人結直腸癌HCT116細胞和HT29細胞的增殖和遷移，并阻滯細胞周期于G0/G1期，其分子機制可能與影響細胞周期相關蛋白表達和調控PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路有關。今后，研究人員將應用PI3K/Akt/mTOR信號通路相關抑制劑進行反向驗證，并深入開展相應的體內研究，從而進一步證實扁蒴藤素的生物學作用。