具有CCCH鋅指結構域的蛋白質12D在肺腺癌中的表達、預后及免疫特征分析

李義帥, 王 愿, 張 磊, 朱龍玉, 秦學博,段小亮, 王 敏, 李建行

(河北省胸科醫院, 1. 胸三科, 2. 腫瘤二科, 河北 石家莊, 050000;3. 河北醫科大學附屬第四醫院 放療科, 河北 石家莊, 050035)

非小細胞肺癌(NSCLC)的治療包括手術切除、化療、放療、靶向治療和免疫治療，上述治療方法均能收獲一定的效果，但患者的生存率仍較差[1]。肺腺癌(LUAD)是NSCLC最常見的類型，約占所有肺癌患者的40%[2]。近期的研究[3]也闡明了LUAD中的各種免疫細胞浸潤。隨著對病因和發病機制的深入研究，免疫反應被認為對LUAD的發展至關重要，提示腫瘤免疫反應的改善或可提高患者總生存率。免疫治療已被廣泛應用于肺癌患者中，包括細胞毒性T淋巴細胞相關抗原抑制劑和免疫檢查點抑制劑[4]。

CCCH型鋅指蛋白家族由4個成員組成，即ZC3H12A、ZC3H12B、ZC3H12C和ZC3H12D[5]。具有CCCH鋅指結構域的蛋白質12D(ZC3H12D)主要表達于人體的巨噬細胞、淋巴細胞、淋巴結、脾臟和肺組織中，該分子具有一個獨特的鋅指結構和一段脯氨酸富集區，可能具有潛在的結合和調節RNA的活性[6]。ZC3H12D具有影響腫瘤細胞周期和誘導腫瘤細胞凋亡的作用[7-8]。作為肺癌中的一種新型抑癌基因,ZC3H12D在LUAD中的作用及機制尚不清楚。本研究探討ZC3H12D預測LUAD患者預后及免疫治療效果的價值，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 RNA測序數據和生物信息學分析

從癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載了來自LUAD項目的轉錄組RNA-seq數據(level 3, FPKM, 535例LUAD, 59例癌旁)和臨床信息(包含生存狀態和生存時間)。篩選無臨床資料和隨訪時間<30 d的LUAD病例，然后將3級FPKM轉換為TPM (transcripts per million reads, 即每百萬reads中來自于某轉錄本的讀段數)，以進行量化和比較。采用基線資料表收集患者的TNM分期、病理分期、年齡、性別、吸煙情況、主要治療結果、生存狀態等特征。本研究完全滿足TCGA的出版指南(http://cancergenome.nih.gov/abouttcga/policies/publicationguidelines), 并結合GTEx正常肺組織樣本的數據，增加對照樣本的數量。最后,ZC3H12D被確定為LUAD患者的預后候選基因。

1.2 多模型的預后分析

采用Kaplan-Meier生存曲線和受試者工作特征(ROC)曲線分析ZC3H12D對LUAD患者的預后和診斷價值，其中預后指標包括總生存期(OS)、疾病特異性生存期(DSS)和無疾病進展間期(PFI); 采用單因素和多因素回歸分析探討ZC3H12D表達與LUAD患者OS的相關性，并基于ZC3H12D水平與T分期、N分期、M分期、病理分期和腫瘤原始治療效果單變量Cox模型中的OS事件構建列線圖。當P<0.05時, Cox回歸分析有統計學意義。

1.3 蛋白質互作網絡及功能分析

GeneMANIA數據庫(http://genemania.org/)是一個蛋白互作網站，包含基因信息，分析基因列表，并使用高精度的預測算法為功能分析確定基因優先級[9]。本研究通過該數據庫分析了與ZC3H12D相互作用的蛋白，并進行了相關信號通路分析。

通過DAVID數據庫(https: //david. ncifcrf. gov)對與ZC3H12D相互作用的蛋白進行基因本體論(GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,P<0.05為差異有統計學意義，應用R軟件及相應的clusterProfiler包進行注釋及可視化。

1.4 免疫細胞浸潤的相關性分析

腫瘤免疫估計資源(TIMER)數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是系統性分析不同癌癥類型免疫細胞浸潤的在線數據庫[10]。本研究使用TIMER和單樣本基因集富集分析(ssgsGSEA)來評估ZC3H12D與腫瘤純度以及多種免疫細胞之間的關系，包括B細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞。采用Spearman相關分析法研究ZC3H12D與免疫細胞浸潤的相關性。使用correlation模塊分析基因表達之間的相關性。使用GSVA軟件包檢測ZC3H12D與其他免疫細胞的相關性。本研究通過分析TISIDB(http://cis.hku.hk/TISIDB)數據庫，分析了ZC3H12D與免疫亞型的關系[11]。

1.5 統計學分析

采用R軟件(v. 3.6.3)計算數據，應用survival包(3.2-10版本)進行生存資料的統計分析, survminer包用于可視化分析, pROC包用于分析ROC曲線, ggplot2包用于可視化分析, rms包(6.2-0版本)和survival包(3.2-10版本)用于列線圖的構建。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ZC3H12D在LUAD中高表達

利用從TCGA數據庫下載的泛癌數據評估ZC3H12D的表達水平，結果顯示,ZC3H12DmRNA在乳腺癌、膽管癌、結直腸癌、食管癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肝癌、LUAD、胃腺癌和胸腺瘤中高表達; 與正常組織相比, LUAD組織中ZC3H12D表達水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。ROC曲線分析顯示, ZC3H12D診斷LUAD的曲線下面積(AUC)為0.731(95%CI: 0.669～0.792), 表明ZC3H12D對LUAD具有中等的識別能力。

A: TCGA和GTEx正常組織與泛癌組織中ZC3H12D的表達; B: LUAD組織(n=513)與正常組織(n=59)中ZC3H12D表達比較; C: LUAD組織與配對癌旁組織(n=57)中ZC3H12D表達比較; D: ZC3H12D診斷LUAD的ROC曲線。圖1 ZC3H12D在不同組織中的差異表達

2.2 ZC3H12D表達與臨床病理特征的關系

ZC3H12D與T分期、N分期、病理分期、初始治療效果和總生存預后有相關性(P<0.05), 與性別、年齡、吸煙、M分期無相關性(P>0.05)。見表1、圖2。

表1 LUAD患者ZC3H12D表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

A: ZC3H12D表達與年齡的關系; B: ZC3H12D表達與性別的關系; C: ZC3H12D表達與吸煙的關系; D: ZC3H12D表達與T分期的關系; E: ZC3H12D表達與N分期的關系; F: ZC3H12D表達與M分期的關系; G: ZC3H12D表達與病理分期的關系; H: ZC3H12D表達與初始治療效果的關系; I: ZC3H12D表達與總生存預后的關系。兩者比較, **P<0.01, ***P<0.001。圖2 ZC3H12D表達與臨床病理特征的關系

2.3 高表達ZC3H12D與LUAD不良預后的關系

采用Kaplan-Meier生存分析評估ZC3H12DmRNA表達的預后意義，較高的ZC3H12D表達與較短的OS[HR(95%CI)為0.49(0.36～0.66),P=0.001]、DSS[HR(95%CI)為0.45(0.31～0.65),P<0.001]和PFI[HR(95%CI)為0.66(0.51～0.86),P=0.002]顯著相關。對OS進行的單因素Cox回歸分析結果顯示，除ZC3H12D外，其他臨床病理特征如T分期、N分期、M分期、病理分期、初始治療結果也與LUAD預后具有相關性(P<0.05)。納入顯著性變量，構建OS的多變量模型，結果顯示ZC3H12D仍是LUAD預后的影響因素[HR(95%CI)為0.509(0.332～0.781),P=0.002]。本研究基于單變量Cox回歸結果構建了列線圖，該列線圖的一致性指數為0.723(95%CI: 0.731～0.793), 有1 000次bootstrap重復; 校準圖表明列線圖與LUAD中觀測到的OS概率具有良好的一致性。見表2、圖3。

表2 基于OS的單因素及多因素分析

A、B、C: ZC3H12D不同表達水平者的總生存期、疾病特異性生存期、無疾病進展間期曲線; D: 預測LUAD患者1、3、5年總生存率的列線圖; E: LUAD患者1 000次bootstrap重復的Nomogram校準曲線。圖3 基于ZC3H12D的LUAD患者預后分析及Nomogram模型構建

2.4 蛋白質互作網絡的構建與信號通路分析

GeneMANIA網站分析結果顯示，可能與ZC3H12D相互作用的蛋白有ZC2H12A、ZC2H12B、N4BP1、ZC2H12C、KHNYN、RPGRIP1L、NYNRIN、NYNRIN、OR2V2、GPR75、ZNF488、FCER2、ZNF280B、GRAP、P2RX5、SLAMF6、CD80、TCF7、AICDA、PARP15和TUBB1。功能富集分析結果顯示的通路包括alpha-beta T cell differentiation involved in immune response、CD4-positive，alpha-beta T cell differentiation involved in immune response、T-helper cell differentiation、alpha-beta T cell activation involved in immune response、T cell differentiation involved in immune responseCD4-positive, alpha-beta T cell differentiation和CD4-positive, alpha-beta T cell activation。見圖4。

圖4 ZC3H12D互作蛋白網絡及功能分析

進一步將與ZC3H12D相互作用的蛋白進行GO和KEGG富集分析，功能主要集中在趨化因子-趨化因子受體結合、原始免疫反應、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路、PD-L1和PD1檢查點信號通路以及T細胞激活、B細胞激活、淋巴細胞激活、淋巴細胞增殖等方面。見圖5。

A: 生物過程; B: 分子功能; C: 細胞組分; D: KEGG通路。圖5 ZC3H12D互作蛋白的GO和KEGG富集分析

2.5 免疫細胞浸潤的相關性分析

本研究進一步分析了ZC3H12D表達水平與免疫細胞浸潤的相關性。TIMER數據庫分析提示, ZC3H12D與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的差異均有統計學意義(P<0.05)。對LUAD腫瘤微環境中的24種免疫細胞進行ssGSEA分析，使用GSVA軟件包檢測ZC3H12D與其他免疫細胞之間的相關性，22種免疫細胞的浸潤與ZC3H12D相對豐度呈正相關, Tgd細胞和Th2細胞與ZC3H12D僅呈負相關(P<0.05), 特別是不同T細胞亞群與ZC3H12D的相關性更強，包括T細胞、Tfh細胞、細胞毒T細胞、Th1細胞、TReg細胞、Tem細胞和B細胞，進一步說明了ZC3H12D與多種免疫細胞浸潤有很強的相關性。利用免疫亞型的分子分型，作者研究了ZC3H12DmRNA在不同免疫亞型中的表達。在LUAD中，在C1(傷口愈合)、C2(IFN-γ占優勢)、C3(炎癥)、C4(淋巴細胞減少)和C6(TGF-β占優勢)亞型中觀察到ZC3H12D表達特征的顯著差異，在LUAD中C3亞型表達量最高，提示不同免疫亞型中ZC3H12D的差異表達可能部分解釋了ZC3H12D在癌癥的預后中發揮了不同的作用。見圖6。

A: 通過TIMER分析ZC3H12D與LUAD的腫瘤純度及免疫浸潤水平有關; B: 24種免疫細胞浸潤與LUAD中TSPOAP1-AS1表達的總體關系; C: 通過TISIDB分析ZC3H12D表達與LUAD免疫亞型的關系。圖6 LUAD中ZC3H12D表達與免疫浸潤水平的相關性

3 討 論

肺癌是導致癌癥相關死亡的主要原因，癌癥的生存率很大程度上取決于診斷時的疾病發展階段，但40%～60%的肺癌患者直到晚期才被診斷出來[12]。本研究觀察到LUAD中ZC3H12D的表達升高，與更差的OS、DSS和PFI相關，提示ZC3H12D與LUAD的免疫浸潤水平相關，可影響預后。ZC3H12A在T細胞介導的免疫抑制中發揮關鍵作用。然而，轉化濾泡淋巴瘤(TFL, ZC3H12D)是屬于regnas1家族(ZC3H12A)的核糖核酸酶(RNase), 最初被報道為腫瘤抑制基因。雖然ZC3H12D尚未被廣泛研究，但其抗腫瘤特性已在細胞實驗中得到證實。研究[13]發現ZC3H12D在3′UTR中的作用與ZC3H12A相同。有研究[14]報道了人初級記憶T淋巴細胞與ZC3H12D表達的關系。研究[15]顯示, ZC3H12D與子宮內膜癌患者的生存密切相關。本研究分析顯示, ZC3H12D在LUAD組織中顯著上調，且診斷價值的AUC為0.731, 說明該基因的差異表達可以區分LUAD患者和健康個體，具有較高的敏感性和特異性。

本研究利用蛋白質互作網絡鑒定了ZC3H12D的共調控蛋白，包括ZC2H12A、ZC2H12B、N4BP1、ZC2H12C、KHNYN、RPGRIP1L、NYNRIN、NYNRIN、OR2V2、GPR75、ZNF488、FCER2、ZNF280B、GRAP、P2RX5、SLAMF6、CD80、TCF7、AICDA、PARP15和TUBB1, 主要富集在與T細胞相關的免疫信號通路。ZC3H12D作為鋅指蛋白家族中的一員，在人體中主要表達于巨噬細胞、淋巴細胞、淋巴結、脾臟和肺組織中。因此，當ZC3H12D在癌細胞中表達升高時，可能通過調控免疫細胞的激活或功能來調控腫瘤細胞。本研究發現ZC3H12D的上調與更差的OS、DSS和PFI有關。單因素和多因素分析表明, ZC3H12D的高表達是LUAD患者OS的獨立影響因素。ZC3H12D的表達水平與T分期、N分期、病理分期、初始治療效果和總生存預后顯著相關。本研究基于上述病理特征和ZC3H12D的表達構建預測LUAD總生存率的列線圖，其1、3、5年校準曲線表明該列線圖具有準確的短期和長期預測能力。

近年來，腫瘤免疫治療極大地改變了腫瘤患者的管理模式，免疫系統在癌癥發展和進展中的作用愈發受到重視[16-18]。探索腫瘤微環境作為預后和診斷的生物標志物或治療靶點是極有價值的研究領域[19]。免疫檢查點阻斷療法提高了晚期黑色素瘤、NSCLC和其他癌癥患者的生存率，但單藥程序性死亡受體-1(PD-1)抑制劑的抗腫瘤作用有限，有效應答率低于30%[20]。本研究發現ZC3H12D在腫瘤免疫機制中發揮作用，而ZC3H12D的表達與LUAD的免疫浸潤水平密切相關。在人體內分離CD4+T細胞的實驗[21]發現, ZC3H12D的缺乏可增加T淋巴細胞的促炎表型。本研究結果顯示, ZC3H12D的表達與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞的水平呈顯著正相關。

在NSCLC腫瘤微環境中，浸潤性免疫細胞占很大比率，主要是T細胞，其次是B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞[22-23]。樹突狀細胞是一種特殊的抗原提呈細胞，在抗腫瘤T淋巴細胞的激活中發揮重要作用[24]。T細胞的浸潤水平通常可以預測患者更好的臨床結果[25]。此外，腫瘤浸潤的B細胞在腫瘤微環境中的作用也越來越受到關注，研究[26]表明NSCLC中B細胞的浸潤具有良好的結果。在未接受PD-1/程序性死亡受體-1配體(PD-L1)抑制劑治療的NSCLC患者中，較高的T和B漿細胞水平與較好的預后相關[27]。本研究結果顯示, ZC3H12D與肺腺狀細胞癌中的巨噬細胞相關。然而，巨噬細胞在肺癌發展和激活中的作用仍存在爭議[28]。一般來說, 腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)起著促腫瘤的作用，但在適當的刺激下, TAMs也可能有能力與T細胞合作發揮抗腫瘤作用[29]。本研究結果顯示, ZC3H12D在LUAD中能夠招募和調節免疫細胞浸潤。研究[30]表明Th1 CD4+T細胞、Th2 CD4+T細胞、Th17 CD4+T細胞浸潤腫瘤可介導晚期實體腫瘤的消退。

本研究仍存在一些局限性，例如TCGA數據庫中正常樣本數量較少、未使用動物模型驗證假設。當然，這些因素需要在進一步的研究中得到驗證。因此，本研究將在后續研究中建立細胞和動物模型，通過實驗進一步證明本研究結論。

綜上所述, ZC3H12D在LUAD中高表達，是獨立預后指標，且能影響免疫細胞浸潤水平，或可作為LUAD潛在的診斷及預后生物標志物。