宏基因二代測序對結締組織病并發免疫抑制宿主肺炎患者的病原學分析

張安兵 袁小玲 夏秀瓊 呂燕華 張丹丹 梁劍平

近年來，隨著診療技術不斷提高，結締組織病(Connective tissue disease，CTD)發病率也越來越高，患者死于原發病的比例逐年下降[1]。但是，由于病人的生存時間延長及糖皮質激素、免疫抑制劑的長期使用，合并肺炎患者的比例也逐漸升高[2]。因該類患者免疫力低下，感染特殊、罕見病原體較多，臨床經驗性抗感染治療難度大，傳染病原學檢測方法耗時長、陽性率不高。因此，臨床上亟需新的檢測方法來快速、準確診斷感染病原體，為臨床“靶向”抗感染治療提供客觀依據。宏基因二代測序技術(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)被逐漸應用于臨床病原體檢測，現將我科近3年結締組織病并發免疫抑制宿主肺炎患者的臨床資料進行mNGS結果分析，從而概括出該類患者的病原學分布，旨在為這類患者早期經驗性抗感染治療提供參考。

資料與方法

一、研究對象

選取符合入選標準的我院呼吸與危重癥醫學科2019年1月至2021年7月收治的結締組織病并發免疫抑制宿主肺炎患者為研究對象。

納入標準：①符合2019年美國感染病學會/美國胸科學會(IDSA/ATS)“成人社區獲得性肺炎診治指南”對社區獲得性肺炎的診斷標準[3]；②所有患者均診斷為結締組織病；③患者使用糖皮質激素和(或)免疫抑制時間≥1個月；④年齡≥18歲。

排除標準：①結締組織疾病累及肺部；②患獲得性免疫缺陷綜合征者；③粒細胞缺乏者；④嚴重肝功能、腎功能損害者；⑤合并急性心力衰竭者；⑥合并各種腫瘤；⑦妊娠或哺乳期婦女；⑧存在纖支鏡檢查禁忌癥者。

二、研究方法

將符合入選標準的32例患者納入研究，所有患者均完成纖支鏡肺泡灌洗術；患者肺泡灌洗液樣本均干冰保存送至廣州達安臨床檢驗中心行mNGS檢測，mNGS標本的采集、保存和運輸均按照該公司標準化規范執行。

收集患者性別、年齡、體重指數(BMI)、吸煙史、基礎疾病、使用免疫抑制劑情況、血常規白細胞計數(WBC)、血常規中性粒細胞比例(N%)、胸部CT結果、肺炎嚴重指數評分(PSI評分)等一般資料(見表1)。收集患者肺泡灌洗液mNGS及傳統檢測方法病原學結果并進行回顧性分析。

三、統計學方法

結 果

一、患者一般情況

32例患者中，女性25例(78.13%)，男性7例(21.87%)，年齡25歲～78歲，平均年齡(56.72±11.75)歲，有吸煙史者9例，BMI(21.23±3.45)kg/m2。32例患者中系統性紅斑狼瘡9例(28.12%)，干燥綜合征6例(18.75%)，硬皮病5例(15.63%)，皮肌炎5例(15.63%)，變應性血管炎4例(12.50%)，類風濕性關節炎3例(9.37%)。32例患者中僅使用激素治療者23例，同時使用激素和其他免疫抑制劑者9例；激素、免疫抑制劑使用時間1～3個月的11例，3個月以上的21例。患者WBC(15.63±4.53)×109/L，N%(87.87±8.63)%，CRP(93.68±10.26)mg/L，PCT(1.83±0.73)ng/mL，PO2(85.21±7.97)mmHg，PSI評分(63.58±9.76)。32例患者中病變為實變影9例(28.12%)，磨玻璃樣影6例(18.75%)，斑片影6例(18.75%)，混合改變11例(34.38%)。

二、患者mNGS與傳統檢測方法病原學結果比較

32例患者中有28例肺泡灌洗液mNGS檢測陽性(檢出率87.50%，95%CI為1.354～16.936)，其中細菌15例(46.88%，陰性菌12例、陽性菌3例)；真菌13例(40.63%，其中耶氏肺孢子菌6例、曲霉菌3例、白色念珠菌2例、光滑念珠菌2例)，均為激素或免疫抑制劑使用時間3個月以上的患者；病毒7例(21.88%，其中巨細胞病毒4例、人類皰疹病毒2例、呼吸道合胞病毒1例)，均為激素或免疫抑制劑使用時間3個月以上的患者，該7例病毒感染均為與其他細菌或真菌的混合感染(見表1)。

32例患者中有19例患者傳統病原學檢測陽性(檢出率59.37%，95%CI為0.303～2.829)，其中培養出細菌11例(34.37%)，培養出真菌8例(25%)，G實驗和(或)GM實驗8例陽性(25%)，病毒核酸或病毒抗體檢測6例陽性(18.75%)(見表1)。

表1 患者病原學檢查結果

肺泡灌洗液mNGS病原學檢測陽性率明顯高于傳統檢測方法(87.50% vs 59.37%，χ2=6.488，P=0.01)(見表2)。

表2 兩組患者病原學檢測陽性率比較

討 論

結締組織病(CTD)是一組系統性自身免疫性疾病，糖皮質激素和免疫抑制劑是其常規治療藥物，該類藥物長期使用不同程度抑制了患者的免疫力，增加感染風險，肺部感染最為常見[4-5]。合并免疫抑制宿主肺炎患者感染病原體往往為罕見或特殊病原體，部分患者存在混合感染，這類患者往往經驗性抗感染治療效果不佳，病原學診斷困難[6]。傳統病原學檢測方法陽性率低、培養周期長，難以指導臨床抗感染治療，宏基因二代測序(mNGS)作為一種新的病原學檢測方法逐漸應用于臨床。

mNGS能一次性并行對幾百萬條DNA分子進行序列測定，能夠檢測出可培養和不可培養微生物的基因序列，繞過了微生物的分離和培養過程，具有病原體檢出陽性率高、靈敏性及特異性高等特點，且不受宿主因素、激素使用的影響[7-10]。因此，我們試圖探討mNGS技術對結締組織病合并免疫抑制肺炎病原體檢測的應用價值

本研究中肺泡灌洗液mNGS病原體檢測陽性率達87.5%，明顯高于傳統檢測方法陽性率59.37%(χ2=6.488，P=0.01)。林明珍等[11]報道mNGS對初治失敗的社區獲得性肺炎病原體檢測陽性率明顯高于傳統檢測(85.06% vs 8.04%，P<0.05)。鈕月英等[12]報道肺泡灌洗液mNGS對下呼吸道感染病原體檢測的陽性率高于傳統培養(69.6%vs25.0%，P<0.05)，mNGS陽性結果調整抗感染藥物后治療效果，明顯好于經驗性抗感染治療(88.0%vs40.0%，P<0.05)。據謝栓栓等[13]報道mNGS診斷病原體陽性預測值(91.23%)和陰性預測值(30.56%),顯著高于培養法診斷病原體的陽性預測值(87.50%)和陰性預測值(18.84%)。對于mNSG檢測病原體陰性的患者，可盡早開始肺活檢排除其他疾病可能。

本研究mNGS檢測結果顯示免疫抑制宿主肺炎患者感染病原體占比由高到低，依次為細菌、真菌、病毒。細菌中以革蘭陰性菌為主，占比80%，與郭嬌等[6]報道的88.89%相似，革蘭陰性菌中又以銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌為主，革蘭陽性菌以金黃色葡萄球菌為主。因此，這類肺炎患者經驗性調整抗感染時，可考慮抗銅綠假單胞菌的β-內酰胺類藥物、氟喹諾酮類藥物，必要時加用覆蓋金黃色葡萄球菌的萬古霉素或替考拉寧、利奈唑胺。本研究中所有真菌感染者激素、免疫抑制使用時間，均超過3個月，Ford E.S.等報道[14]潑尼松15～20mg/d使用超過3周的患者發生耶氏肺孢子菌肺炎的風險顯著增加，本研究中耶氏肺孢子菌占真菌感染比例高達46%(6例)，曲霉菌15%(3例)；賈建超等[15]報道20例重癥真菌肺炎患者mNGS檢測檢出肺孢子菌55%(11例),曲霉菌30%(6例)，與我們的研究結果相似。因此，對于激素和(或)免疫抑制劑使用時間超過3個月的患者，應當常規檢測G試驗、GM試驗，并考慮是否開始抗真菌治療，臨床上可予伏立康唑聯用復方磺胺甲噁唑，經驗性覆蓋肺孢子菌、曲霉等真菌。免疫功能受損患者易合并病毒感染，本研究中檢出病毒感染7例，巨細胞病毒占檢出病毒比例達57%，這些患者激素或免疫抑制劑使用時間均超過3個月，且胸部CT均存在磨玻璃樣陰影；對這些患者經驗性抗感染治療效果欠佳時，應考慮巨細胞病毒、人類皰疹病毒感染可能；對此類患者應常規行病毒核酸或抗體檢測，若結果陽性，應予更昔洛韋抗病毒治療。本研究中7例病毒感染均為與細菌或真菌的混合感染；姚仲偉等[16]報道在復合感染中mNGS對病原體的診斷效能明顯高于傳統培養(58.6%vs.27.6%，P=0.017)。

綜上所述，結締組織病合并免疫抑制宿主肺炎患者，病情復雜，早期進行肺泡灌洗液mNGS檢測，可快速明確致病病原體，從而針對性選擇抗感染藥物，以便提高患者治療成功率、減少抗感染藥物使用種類。我們也期待大樣本量的前瞻性研究能夠為這類患者的抗感染治療提供更多證據。