非小細胞肺癌來源外泌體的免疫效應和潛在生物標志物

賈俊斌 顧巖,2

據2018年全球腫瘤統(tǒng)計分析報告顯示，肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌病理分類為非小細胞肺癌(Non-Small-Cell Lung，NSCLC)和小細胞肺癌(Small-Cell Lung，SCLC)，其中NSCLC是最常見的病理組織學類型，包括腺癌、鱗狀細胞癌,大細胞癌和鱗腺癌等，占到所有肺癌的85% , 其5年生存率僅為16%[2]。NSCLC早期時缺乏典型臨床癥狀，不易被察覺，多數的NSCLC患者確診時已處于晚期，預后較差。盡管肺癌治療的方法不斷在進展，除傳統(tǒng)的手術、放療、化療外，本世紀初，針對驅動基因陽性靶向治療的問世，顯著延長了患者的總生存期，但其遠期療效仍有待提高，目前，免疫檢查點抑制劑(ICIs)已被用作晚期NSCLC的一線治療藥物，其具有代表性的PD-1/PD-LI單抗，能夠抑制腫瘤應答T 細胞表面的PD-1受體與腫瘤細胞表面的PD-L1配體結合，再次激活T細胞，發(fā)揮殺死腫瘤細胞的作用。ICIs被批準用于肺癌的治療為NSCLC患者帶來了新的希望，且取得了突破性的進展，但僅約20%患者在接受治療后獲得了長期療效,且多數患者后期復發(fā)，預測免疫治療療效生物標志物的不足與腫瘤免疫微環(huán)境的復雜和免疫逃逸，是導致療效不理想的重要原因。近年研究表明，腫瘤源性外泌體(tumor-derived exosome，TEX)對腫瘤發(fā)生、腫瘤生長、信號轉導和進展有巨大的影響。它們在細胞間通信和在癌細胞與周圍細胞之間運輸豐富的小分子和信號分子(組成腫瘤微環(huán)境(TME)中發(fā)揮重要作用[3-4]。因此探究非小細胞肺癌來源外泌體的免疫效應，對NSCLC免疫治療的作用變得至關重要，本綜述主要對非小細胞肺癌來源外泌體參與NSCLC腫瘤免疫微環(huán)境中的作用和潛在生物標志物探索的近年研究進展進行歸納綜述。

腫瘤源性外泌體簡介

細胞外囊泡通常分為兩類，即胞外體和外泌體，胞外體是由質膜直接向外出芽產生的囊泡，可以產生微囊泡、微粒和大囊泡，直徑范圍為50nm～1000nm，外泌體起源于核內體，由脂質雙層膜組成，直徑范圍為40～160nm(平均100nm)。外泌體的產生過程包括質膜的雙重內陷和細胞內多泡體(multivesicular bodies，MVBs)的形成，其中包含腔內小泡(intraluminal vesicles，ILVs)，通過MVB與質膜融合和胞外分泌，ILVs最終作為外泌體分泌[5]。外泌體包含膜蛋白、胞質及核蛋白質,細胞外基質蛋白,代謝物,核酸,即mRNA、非編碼RNA和DNA[6-7]，可反映它們的來源細胞。外泌體是細胞間通訊的中介，與免疫反應、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中樞神經系統(tǒng)相關疾病和癌癥進展相關[5]。腫瘤與免疫相關研究成為熱點領域，源自腫瘤細胞分泌的外泌體，稱為腫瘤源性外泌體(TEX)，同樣擁有上述結構和遺傳特性。腫瘤源性外泌體是腫瘤細胞與宿主細胞之間細胞內通訊的主要機制，使腫瘤細胞能夠調節(jié)周圍環(huán)境，為腫瘤的發(fā)生和發(fā)展創(chuàng)造最佳的微環(huán)境[8]；Weidle和 Lobb的研究表明腫瘤源性外泌體在腫瘤轉移前微環(huán)境的形成及轉移過程中起著重要的中介作用[9-10]；同時腫瘤源性外泌體含有多種免疫刺激和免疫抑制因子，通過影響受體細胞的基因表達和信號通路來調節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫反應參與細胞的重編碼，在多種類型癌中被證明：如晚期宮頸鱗狀細胞癌細胞分泌的外泌體將miR-142-5p傳遞給淋巴內皮細胞，并通過ARID2-DNMT1-IFN-γ信號通路誘導吲哚胺2,3-雙加氧酶表達，從而抑制和消耗CD8(+) T細胞[11]調節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，胰腺癌來源的外泌體miR-212 3p下調樹突狀細胞中MHC-Ⅱ轉錄因子RFXAP(調控因子X相關蛋白)，可能促進癌細胞的免疫逃逸[12]。因此腫瘤源性外泌體與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關，近年來非小細胞肺癌(NSCLC)來源外泌體的研究也得到了廣泛重視。

NSCLC來源外泌體在腫瘤免疫微環(huán)境中的作用

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤或癌癥干細胞存在的細胞環(huán)境，包括周圍的免疫細胞、血管、細胞外基質、成纖維細胞、淋巴細胞、骨髓源性炎癥細胞和信號分子[13]。隨著腫瘤與宿主之間免疫反應的研究，對腫瘤微環(huán)境中免疫環(huán)境(腫瘤免疫微環(huán)境)多樣性和復雜性有了進一步認識，可能影響腫瘤的發(fā)生和治療[14]。

一、NSCLC來源外泌體參與免疫細胞的調節(jié)

NSCLC免疫治療的抗腫瘤作用是免疫細胞與腫瘤細胞相互作用的結果，而NSCLC來源的外泌體對免疫微環(huán)境中多種免疫細胞有直接或間接的影響。在腫瘤微環(huán)境中，樹突狀細胞促進腫瘤的發(fā)生起重要作用，將腫瘤細胞釋放的抗原提呈給免疫效應細胞，有研究指出肺癌活檢分離出的外泌體中，大約80%含有表皮生長因子受體(Endothelial Growth Factor Receptor，EGFR)， EGFR具有誘導耐受性樹突狀細胞和調節(jié)性T細胞的潛力，最終導致腫瘤抗原特異性CD8+T細胞的抑制,[15]造成腫瘤免疫逃逸。巨噬細胞可被腫瘤細胞分泌的某些因子馴化，成為免疫抑制性腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAM)，在腫瘤進展過程中，循環(huán)的單核細胞和其他炎性淋巴細胞被招募到腫瘤組織中,改變腫瘤微環(huán)境。單核細胞是TAM的前體，能夠在炎性腫瘤微環(huán)境中持續(xù)生存并產生TAM[16]。腫瘤源性外泌體在單核細胞存活和腫瘤炎性微環(huán)境內TAM生成中具有關鍵作用[8]，在NSCLC患者的TAM分泌TNFα促進腫瘤細胞糖酵解，增加腺苷酸激活蛋白激酶和過氧化物酶體增殖物激活受體共激活因子1- α促進腫瘤缺氧[17]，可能阻礙抗PD-L1治療NSCLC的療效。腫瘤細胞上表達的PD-L1與免疫細胞上的PD-1受體結合時，這種相互作用導致細胞毒性CD8+T淋巴細胞的增殖、存活和效應功能受到抑制，從而誘導腫瘤浸潤T細胞凋亡。最新的研究表明NSCLC分泌的含PD-L1的外泌體可能通過PD-1/PD-L1相互作用調節(jié)T細胞中的IFN-γ信號通路從而抑制T細胞的活性和促進腫瘤細胞的生長[18]。

二、NSCLC來源外泌體調節(jié)微環(huán)境促進腫瘤的發(fā)展和轉移

上皮間充質轉化(Epithelial MesenchymalTransition，EMT)是上皮細胞獲得間充質細胞特性的過程，使細胞具有侵襲性。從晚期NSCLC患者血清中分離出的TEX，與高度轉移的癌細胞一樣，含有高水平的波形蛋白，并可誘導受體人支氣管上皮細胞發(fā)生EMT[19]從而導致腫瘤的轉移和發(fā)展。NSCLC的TEX對腫瘤血管的生成以及轉移前微環(huán)境的形成起重要作用，金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1表達在肺癌的所有分期和類型中都升高，特別是在肺腺癌中，在PI3K/Akt/HIF-1通路的控制下，過表達TIMP-1可誘導肺腺癌細胞及其分泌的外泌體中致瘤miR-210的表達，而這些表達miR-210的TEX下調了內皮細胞(ECs)中的促紅細胞生成素肝細胞受體配體A3(EphrinA3)，促進血管生成[20]。非小細胞肺癌源性外泌體的微小RNA(MicroRNA,miRNA)通過選擇性靶向和激活肺上皮細胞中的TLR3促進癌細胞轉移前生態(tài)位的形成，這導致了增強的趨化因子分泌和隨后的中性粒細胞募集到肺，共同促進轉移前微環(huán)境的形成[21]。因此，NSCLC源性外泌體對調節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，介導腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉移及免疫逃逸，發(fā)揮重要作用，這可能是造成NSCLC的免疫治療特異性差的重要原因。

NSCLC來源外泌體有成為NSCLC免疫治療生物標志物的潛力

ICIs在NSCLC治療取得了良好療效，對于預測免疫治療療效的生物標志物，以更好選擇合適的患者獲得長久療效方面，仍需要進一步研究，目前用于預測NSCLC免疫治療療效的主要生物標志物有腫瘤組織PD-L1的表達和腫瘤突變負荷(TMB)，但各有其不足[22]，且與療效的相關性并不高。腫瘤源性外泌體攜帶蛋白質和核酸等物質，與腫瘤細胞性質關系密切，參與腫瘤細胞與宿主細胞的相互交流，越來越多的證據表明腫瘤源性外泌體內容物，有可能成為新的預測免疫治療療效的生物標志物[23]。腫瘤源性外泌體miRNA和PD-L1，在腫瘤免疫微環(huán)境的獨特性使得其得到廣泛關注與重視。

一、NSCLC來源外泌體miRNA的表達

非編碼RNA (Non-coding RNAs, ncRNAs)是一類不能被翻譯成蛋白質的功能性RNA分子。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一類特征明確的長約22nt的ncRNAs ，可以調節(jié)mRNA的表達,通常通過結合轉錄后 3′-非翻譯區(qū) (3′-UTRs)來調節(jié)其靶基因的表達，大量研究表明miRNA可能成為肺腫瘤新的生物標志物[24]，以及對治療有潛在價值。miRNA在腫瘤源性外泌體中表達豐富，用于NSCLC早期診斷及預后已被大量研究。部分外泌體miRNA與肺癌患者PD-L1的表達相關，影響腫瘤的治療，如腫瘤源性外泌體miR200b低表達與NSCLC患者預后不良有關，在NSCLC患者標本中，miR200b與PD-L1的表達呈負相關，miRNA-200b可能是肺癌患者PD-L1表達的潛在生物標志物[25]，PD-L1的表達仍是臨床常用的預測療效的常用指標，miRNA-200b可能成為預測NSCLC免疫治療療效的一種輔助因子。NSCLC源性外泌體miRNA可能通過調控腫瘤免疫微環(huán)境，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，有研究指出非小細胞肺癌來源的低表達miR-34c-3p的外泌體，通過上調整合素α2β1促進非小細胞肺癌的侵襲和遷移[26]。Kim等研究指出非小細胞肺癌中，腫瘤中RCAN1.4的表達水平明顯低于正常肺組織，miR-619-5p的表達水平明顯高于正常肺組織，腫瘤來源的外泌體miR-619-5p通過抑制RCAN1.4促進腫瘤血管生成和轉移[27]。推測這些腫瘤源性的外泌體miRNA在正常組織與肺癌組織中表達差異，較大影響腫瘤的進展，可能會導致NSCLC治療療效及預后不良，很有可能成為新的生物標志物。

二、NSCLC來源外泌體PD-L1的表達

部分PD-L1陽性表達的NSCLC患者并沒有從免疫治療中獲益。導致這種令人失望的治療反應的原因尚不清楚，但可能是腫瘤微環(huán)境中PD-L1驅動通路的綜合機制，包括循環(huán)PD-L1的意義尚未完全了解。新的研究表明多種腫瘤細胞分泌的外泌體表達PD-L1已被證實，如黑色素瘤、前列腺癌、小鼠腫瘤細胞系等[28-30]，參與腫瘤免疫抑制調節(jié)通過抑制T細胞活性促進腫瘤生長，與抗PD-L1/PD-1治療耐藥性相關。在NSCLC中腫瘤源性的外泌體表達PD-L1也已被證實，并且這些外泌體參與腫瘤進展[18,31]。此外，PD-L1存在于從NSCLC患者血液中分離出來的外泌體上，PD-L1表達陽性的外泌體通過抑制細胞因子和誘導CD8+T細胞凋亡在腫瘤免疫逃避中比腫瘤相關組織PD-L1發(fā)揮更重要作用[18]。另一研究也指出在NSCLC患者，特別是晚期NSCLC患者的Exo-PD-L1(21.10±11.63 pg/mL 血清)水平高于健康對照組(15.91±6.45 pg/mL 血清)，此外，在NSCLC患者中，較高的Exo-PD-L1含量與腫瘤大小、陽性淋巴結狀態(tài)、遠處轉移和TNM晚期相關，而腫瘤組織免疫組化PD-L1的表達僅與吸煙狀態(tài)與組織學亞型顯著相關[31]，這可能解釋了PD-L1免疫組化表達量預測抗PD-L1/PD-1治療NSCLC療效差的原因，這也為腫瘤源性外泌體PD-L1作為抗PD-L1/PD-1治療新的預測因子提供理論依據。關于腫瘤源性外泌體PD-L1預測療效，已有臨床相關研究，Del等通過PCR檢測黑色素瘤和肺癌血漿源性外泌體PD-L1 mRNA觀察與對nivolumab 和pembrolizumab應答的關系發(fā)現(xiàn)血漿源外泌體中PD-L1 mRNA的表達與黑色素瘤和非小細胞肺癌中抗PD-1抗體的應答相關[32]。近期Shimada等在對120例肺癌患者隨訪過程中，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清源性外泌體PD-L1≥166 pg/mL與CD8+T細胞數量的增加(P=0.014)和腫瘤表面PD-L1陽性(P=0.031)顯著相關，在17例復發(fā)肺癌患者接受PD-1抑制劑治療，PD-1抑制劑包括9種派姆單抗單藥方案、6種尼魯單抗單藥方案和2種聯(lián)合免疫治療方案中，所有血清源性外泌體PD-L1≥166pg/mL的患者對PD-1抑制劑均有疾病控制作用[33]。

NSCLC來源外泌體在免疫治療方面的潛在價值

腫瘤源性外泌體的生物學特性使它們在NSCLC的免疫治療方面有潛在的價值。腫瘤來源的外泌體在腫瘤微環(huán)境中往返于腫瘤和免疫細胞，提供腫瘤特異性抗原，是很有希望的抗癌疫苗候選體，參與腫瘤的免疫治療[22]。Besse[34]等一項研究表明了樹突狀細胞來源外泌體用于NSCLC一線化療后免疫維持治療的價值，證實了樹突狀細胞外泌體疫苗的可行性。NSCLC來源外泌體參與腫瘤的免疫調控，影響NSCLC的免疫治療，主要包括免疫抑制和免疫激活兩個方面。Liu[35]等研究指出，在NSCLC中，腫瘤源性外泌體microRNA-433通過增加CD4+T和CD8+T細胞的浸潤抑制腫瘤的發(fā)生，腫瘤浸潤性CD8細胞與腫瘤免疫治療效應密切相關，其可能是增強免疫治療的關鍵因子；多項研究也表明NSCLC來源外泌體PD-L1與腫瘤免疫治療療效差和預后不良相關，腫瘤源性外泌體PD-L1可能與免疫檢查點抑制劑耐藥相關[18,31-32]，可能是免疫治療的新靶點。在晚期NSCLC患者中，裝載有IFN-γ、MHCⅠ和MHCⅡ限制性癌抗原的樹突狀細胞外泌體增強NK細胞的抗腫瘤免疫功能[34]；另一方面，腫瘤源性外泌體可以調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的抗炎信號，從而有效提高肺癌免疫治療的療效[36]，因此通過阻斷或促進相關腫瘤源性外泌體釋放有利于優(yōu)化腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫反應，增強免疫治療的療效。總之，NSCLC來源外泌體參與腫瘤免疫調控，影響腫瘤免疫治療，NSCLC源性外泌體miRNA和PD-L1可能是一個尚未探索的免疫治療靶點，這可能是克服當前免疫治療耐藥性的突破口，也為NSCLC的治療開創(chuàng)了新思路。

總結與展望

在正常和病理條件下，外泌體介導細胞與其周圍環(huán)境之間信息交流。腫瘤源性外泌體作為腫瘤細胞與腫瘤免疫微環(huán)境之間的重要溝通機制，在腫瘤的進展和轉移中發(fā)揮著重要作用。隨著對NSCLC來源外泌體，在腫瘤免疫微環(huán)境中調控機制的研究，人們越來越清晰NSCLC來源外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性。迄今為止很多數據表明NSCLC來源外泌體有成為NSCLC免疫治療新的預測療效生物標志物的潛力，用單一的NSCLC源性外泌體miRNA/PD-L1預測療效可能存在一定異質性，可將敏感性及特異性較高的一組腫瘤源性外泌體與現(xiàn)有生物標志物結合更好將NSCLC患者分層對于指導治療及預后可能會有突破性的意義。隨著對NSCLC源性外泌體免疫效應與分子機制研究的不斷完善，NSCLC來源的外泌體也可能會成為一種新的免疫治療手段，但腫瘤源性外泌體的使用有一些局限性，如它們的分離、純化和鑒定方法的復雜性，以及其異質性，但是隨著技術的進步以及完善不是其發(fā)展的主要阻礙。然而，要將基于外泌體的技術轉化為臨床應用，還需要更復雜的臨床研究來解決目前外泌體生物學的局限性。隨著NSCLC來源的外泌體在免疫效應以及生物標志物方面的進一步探索，對NSCLC的治療有巨大的潛在價值。