微生物檢定法測定四環(huán)素片含量的不確定度分析

高娟，高霞，亢玉紅

(1.陜西省榆林市藥品檢驗(yàn)所，陜西 榆林 719000；2.榆林學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 榆林 719000)

0 引言

四環(huán)素是一種廣譜抑菌劑，濃度高時(shí)具有殺菌作用，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用。目前其測定含量常用的方法為抗生素微生物檢定法中的管碟法(《中國藥典》2015年版四部通則1201)。參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-12]，文章對四環(huán)素片含量測定結(jié)果進(jìn)行不確定度分析，確定影響不確定度的各個(gè)影響因素，并對不同的不確定度分量進(jìn)行評估，給出測量結(jié)果的置信水平和置信區(qū)間，建立四環(huán)素片含量測定不確定度的方法，確定測量結(jié)果的可信程度，以便于在檢驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，盡量減少實(shí)驗(yàn)中的人為誤差，從而確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ZY-300IV多功能微生物自動(dòng)測量分析儀(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)；CPA225D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研 究 院，效 價(jià)969U/mg，批 號：130306-201419)；四環(huán)素片樣品(桂林南藥股份有限公司，批號：TC200304)；抗生素檢定Ⅱ號培養(yǎng)基(pH為6.5-6.6，北京三藥科技開發(fā)公司，批號：180423)；藤黃微球菌(CMCC(B)28001，中國食品藥品檢定研究院)；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸均為分析純，天津科密歐有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為純化水；實(shí)驗(yàn)中所用刻度吸管、不銹鋼小管、平底雙碟均應(yīng)經(jīng)過滅菌。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品0.01070g，置于100mL的容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸2mL，振搖，使四環(huán)素溶解后，再加滅菌用水稀釋至刻度。精密吸取溶液2份，各10mL置25mL與100mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)稀釋至刻度，溶液濃度分別為40u/mL與10u/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高、低濃度。

1.2.2 供試品溶液的制備

取四環(huán)素片4片，全部研細(xì)，置于1000mL的容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸200mL，振搖，使四環(huán)素溶解后，再加滅菌用水稀釋至每1mL中約含1000單位的懸浮液。分別精密吸取溶液1mL置25mL與100mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)稀釋至刻度，溶液濃度分別為40u/mL與10u/mL，作為供試品溶液的高、低濃度。

1.2.3 雙碟的制備和培養(yǎng)

取平底雙碟6套，分別加入加熱融化的培養(yǎng)基20mL，在碟底部攤布均勻，放在水平臺面上使之凝固，作為底層。另取加熱融化后的培養(yǎng)基50mL，置于50℃的恒溫水浴鍋中恒溫，加入藤黃微球菌菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5mL帶菌培養(yǎng)基，攤布均勻，作為菌層。凝固后，用鋼管放置器放置4個(gè)不銹鋼小管。將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液分別用移液槍定量滴加溶液于不銹鋼小管內(nèi)，在36℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。

1.2.4 抑菌圈直徑的測定和效價(jià)計(jì)算

取出培養(yǎng)16h后的6套雙碟，用抑菌圈測量儀測量各個(gè)抑菌圈的直徑，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法[13]進(jìn)行可靠性測驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)學(xué)模型

采用二劑量法，通過數(shù)學(xué)模型對四環(huán)素片的含量測定進(jìn)行分析，效價(jià)計(jì)算公式[14]如下所示：

其中，P為供試品效價(jià)，AT為供試品的估計(jì)效價(jià)，Ws、Wx分別為標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的質(zhì)量，Ps為標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)值，Vs、Vx分別為標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稀釋倍數(shù)，I為高低濃度之比的對數(shù)值(劑量比為4：1時(shí)，I=0.602)，S1、S2、T1、T2分別為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度、標(biāo)準(zhǔn)品高濃度、供試品低濃度、供試品高濃度溶液所致抑菌圈直徑的總和。

2.2 測量結(jié)果

用抑菌圈測量儀分別對6個(gè)雙碟進(jìn)行掃描測量，結(jié)果見表1，ds1、ds2、dt1、dt2分別為標(biāo)準(zhǔn)品溶液低濃度、標(biāo)準(zhǔn)品溶液高濃度、供試品溶液低濃度、供試品溶液高濃度所致的抑菌圈直徑；ym為一個(gè)雙碟中抑菌圈直徑的總和。

表1 抑菌圈測量儀測量的直徑值(mm)

抑菌圈測量儀測定結(jié)果表明，回歸非常顯著(P＜0.01)，偏離平行不顯著(P＞0.05)，平均可信限率Pt的FL%為4.1%，符合要求(應(yīng)＜5%)，抑菌圈清晰可見，且標(biāo)準(zhǔn)品的高濃度所致的抑菌圈直徑在18-22mm之間，含量測定結(jié)果為944.1U·mg-1，以上結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。

2.3 不確定度來源的分析

標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)品稱量過程中引入的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)品溶解過程引入的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程中引入的不確定度；供試品溶解過程引入的不確定度；供試品稀釋過程引入的不確定度；抑菌圈測量儀測量過程中引入的不確定度；溫度引入的不確定度。

2.4 不確定度分量的計(jì)算

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制引入的不確定度

(1)標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度：四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度一般認(rèn)為是±1%，概率分布為均勻分布，包含因子，則相對不確定度

(2)稱量過程引入的不確定度：根據(jù)證書電子天平(0.01mg)最大允許誤差為±0.03mg，按矩形分布，，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度天平重復(fù)性誤差為±0.05mg，包含因子，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度，天平的合成不確 定 度 為，標(biāo) 準(zhǔn)品的稱量為0.1070g，由天平帶來的相對不確定度

(3)溶解及稀釋過程引入的不確定度

①容量瓶的不確定度：由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[15]查得，A級25mL容量瓶的容量允差為±0.03，按三角分布，包含因子，則不確定度，其相對不確定度為u4=0.0122/25=4.9×10-4；A級100mL單標(biāo)線容量瓶的容量允差為±0.10，按三角分布，包含因子，則不確定度，其相對不確定度為u6=0.0408/100=4.1×10-4，標(biāo)準(zhǔn)品溶解及稀釋過程中共使用25mL容量瓶1次，100mL容量瓶2次，因此定容體積引入的合成不確定度

②移液管的不確定度：A級10mL移液管的容量允差為±0.02，按三角分布，，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋時(shí)，使用10mL移液管2次，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4.2 供試品溶液配制引入的不確定度

(1)容量瓶引入的不確定度：A級1000mL容量瓶的容量允差為±0.40，按三角分布，包含因子則不確定度，其相對不確定度u9=0.1633/1000=1.6×10-4；25mL和100mL容量瓶的不確定度計(jì)算方法同上，供試品溶解及稀釋過程中共使用25mL容量瓶1次，100mL容量瓶1次，1000mL容量瓶1次，則定容體積引入的合成不確定度

(2)移液管引入的不確定度：A級1mL移液管的容量允差為±0.007，按三角分布，，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋時(shí)，使用1mL移液管2次，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4.3 溫度引入的不確定度

供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液在相同條件下配制，膨脹系數(shù)和溫差相同，因此溫度引起的相對不確定度可忽略不計(jì)。

2.4.4 抑菌圈測量儀測量過程中引入的不確定度

(1)抑菌圈測量直徑引入的不確定度：對抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)效價(jià)公式計(jì)算效價(jià)為944.1U·mg-1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得自由度為15，合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差即標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u11=0.1196，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.3×10-4

(2)抑菌圈測量儀的不確定度：抑菌圈測量儀的最大允許誤差為±0.02mm，概率分布為均勻分布，，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為抑菌圈測量儀的標(biāo)準(zhǔn)圈直徑為19mm，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 計(jì)算合成不確定度

2.5.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各項(xiàng)不確定度的分量匯總表，如表2所示。

表2 各項(xiàng)不確定度分量匯總表

上述實(shí)驗(yàn)中的不確定度分量，都是各自獨(dú)立的分量，合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.5.2 擴(kuò)展不確定度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般用擴(kuò)展不確定度來表示，U(y)/y=0.0073，y=944.1U·mg-1，則U(y)=0.0073×944.1U·mg-1= 6.89U·mg-1，按置信概率為95%，包含因子k=2計(jì)算，四環(huán)素片效價(jià)測定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為：U=2U(y)=2×6.89U·mg-1=13.8U·mg-1

2.5.3 不確定度報(bào)告

按照《中國藥典》2015年版四部通則1201使用抗生素微生物檢定法測定四環(huán)素片的含量，該樣品效價(jià)測定的結(jié)果可表示為：(944.1±13.8)U·mg-1(k=2)。

3 討論

3.1 不同影響因素對抗生素微生物檢定法測定不確定度的影響不同，從文中分析的因素來看，標(biāo)準(zhǔn)品的純度對不確定度的影響最大，其次是溶解及稀釋過程中所用的移液管和容量瓶，溫度引起的相對不確定度可忽略不計(jì)。

3.2 《中國藥典》四部通則中抗生素微生物檢定法有兩種方法：管碟法和濁度法，實(shí)驗(yàn)采用的方法為管碟法，此法主要為人工操作，需要實(shí)驗(yàn)人員熟練、認(rèn)真、細(xì)致操作，才能得到正確的檢驗(yàn)結(jié)果，因此抑菌圈直徑值的不確定度與人員關(guān)系最大，進(jìn)而最終影響到相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成。

3.3 本次實(shí)驗(yàn)均采用日常的檢驗(yàn)條件(包括儀器、方法及實(shí)驗(yàn)條件)，通過分析影響四環(huán)素片含量測定的因素，對各個(gè)影響因素進(jìn)行不確定度分析，其結(jié)果可以真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)室日常檢驗(yàn)的水平，并且建立的評定方法可以作為四環(huán)素片含量測定不確定度的分析。

3.4 對測定結(jié)果進(jìn)行不確定度分析，可以體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室檢測水平的高低，同時(shí)也是對實(shí)驗(yàn)室檢測能力的一個(gè)評價(jià)，作為藥品檢驗(yàn)一線工作者，為確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性，我們必須高度重視，對影響不確定度的因素進(jìn)行分析和總結(jié)，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室的檢測能力和水平。