不同窖齡濃香型白酒窖泥細菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性分析研究

唐 云，姚海剛，李彥濤，郭永昌，張 濤，趙 萍，尉軍強，郭濤紅

（1.金徽酒股份有限公司，甘肅隴南 742308；2.蘭州理工大學，甘肅蘭州 730050）

濃香型的白酒具有“窖香濃郁、酯香突出、入口綿柔、香氣豐滿”的風味特點。研究表明由于全國各地自然環(huán)境差異，以及生產(chǎn)原輔料，生產(chǎn)工藝等因素影響，使?jié)庀阈桶拙菩纬闪瞬煌膬纱箫L格，即長江流域“濃郁派”風格和黃淮流域“淡雅派”風格。濃香型白酒的風格與濃香型窖池的窖泥有緊密的聯(lián)系，全國各大酒廠對窖泥的培養(yǎng)及養(yǎng)護都十分重視，且各酒廠配制及養(yǎng)護方法各具特色。窖泥主要作用是為釀酒有益微生物提供生長繁殖場所，通過長期的富集、馴化菌種，形成烏黑、細膩、酯香突出的優(yōu)質(zhì)窖泥。吳冬梅等研究表明新培養(yǎng)的窖泥或使用時間不長的新窖池微生物類別不定因素多，初始泥味重；老窖池的窖泥微生物菌群及酶系豐富多樣，菌株大多已被馴化成型，老熟程度越好的窖池越可能生產(chǎn)出性質(zhì)固定、酒質(zhì)良好的原酒。為探索不同窖齡窖池中微生物的多樣性及地域差異對窖泥微生物的影響，本研究運用高通量測序技術(shù)在各個分類的水平上剖析群落的結(jié)構(gòu)，得出不同窖齡窖池中微生物群落的組成架構(gòu)，準確、完整解析濃香型白酒窖泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)，為窖泥中微生物菌群的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

窖泥：樣品分別來源于金徽酒廠10 年、30 年、60 年老窖和四川某酒廠人工窖泥、10 年、30 年老窖。分別從不同窖齡的窖池窖壁及窖底十字交叉法取混合樣品100 g。

試劑及耗材：DNeasy Power Soil Kit(100)、QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT kit(5)，德 國QIAGEN 公司；Qubit dsDNA Assay Kit，美國Life Technologies；Takara Ex Taq高保真聚合酶。

儀器設備：臺式高速離心機、移液器，德國Eppendorf 公司；PCR 儀，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；QIAxtractor，德國QIAGND 公司；電泳儀、凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；Bioanalyzer，美國Aglient 科技有限公司；tip、離心管，愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥微生物樣品PCR擴增

本研究采用DNeasy PowerSoil Kit 試劑盒對窖泥微生物樣本的基因組DNA 進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度。以稀釋后的基因組DNA 為模板，選取細菌16S rRNA 基因的V3 和V4 區(qū)進行擴增，使用的引物為343F（5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'）和789R（5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）。

1.2.2 擴增子測序及數(shù)據(jù)質(zhì)控

對上述擴增子產(chǎn)物按照二代測序標準建庫方法構(gòu)建測序文庫并使用Illumina MiSeq 平臺進行雙端測序。利用Trimmomatic 軟件去除原始測序數(shù)據(jù)的接頭后，切除堿基平均質(zhì)量值低于20 的窗口并去除長度小于50 bp 的序列。利用Flash 軟件將前述合格的序列進行pair-end 雙端序列拼接，再使用QIIME 軟件去除拼接后含有模糊堿基（N 堿基）、單個堿基重復大于8 或長度小于200 bp 的序列，得到清洗序列（clean tags）。使用UCHIME軟件去除clean tags 中的嵌合體，獲得有效序列（valid tags）。使用Vsearch（version2.4.2）軟件將相似度為97 %的序列劃歸為一個操作分類單元（operational taxonomic units,OTU）并確定每個OTU 的代表序列，再采用RDP classifier Naive Bayesian 分類算法將代表序列與數(shù)據(jù)庫進行比對，得到每個OTU 對應的物種分類信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本取樣分析

對原始測序數(shù)據(jù)進行接頭去除和質(zhì)量控制后，對每個樣本的測序量進行統(tǒng)計，clean tags數(shù)據(jù)量分布在89539～93508 之間，clean tags 經(jīng)過去除嵌合體得到valid tags 數(shù)據(jù)量分布在75607～89235 之間，valid tags 平均長度分布在407.23～425.68 bp，各樣本OTU個數(shù)分布在425～1416之間。

2.2 窖泥原核微生物物種群落Alpha多樣性分析

以對微生物各異性研究的深度和廣度不同為參照，該物種各異性可劃為Alpha 多樣性和Beta 多樣性。Alpha 多樣性分析反映生物環(huán)境內(nèi)物種的多樣性程度。表1匯總了10個樣品的微生物多樣性指數(shù)，老窖泥樣品的微生物多樣性處于較高的水平，一共檢測到30 個綱；金徽10 年窖泥樣品的微生物多樣性最低，一共檢測到22 個綱，優(yōu)勢原核微生物主要集中在Clostridia 和Bacteroidia 中。本研究檢測到的窖泥微生物群落多樣性水平與已有文獻的報道相當。

圖1 樣品有效序列長度二維圖

表1 窖泥中菌群微生物多樣性指數(shù)表

2.3 窖泥原核微生物物種群落Beta多樣性分析

對不同窖齡窖泥樣品中微生物群落進行主坐標軸分析，金徽酒廠不同窖齡的窖泥樣品聚成3類，表明窖泥微生物群落與窖泥質(zhì)量（窖齡）呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。OTU 聚類分析結(jié)果表明，金徽60年老窖池底層和上層窖泥微生物樣品有718 個共同的OTU，30 年老窖池有311 個共同OTU，10 年有170 個共同OTU，隨著窖齡增加。在取樣前期，為保證窖壁完整，車間采用窖底泥修補中層窖壁，因此窖底與窖壁為相同樣本，不作對比分析。相同位置下窖泥樣本的共有OTU 數(shù)量隨使用時間呈現(xiàn)遞增趨勢；同一窖池不同層次窖泥樣本的共有OTU數(shù)量隨窖泥層次的增加自上而下呈遞增趨勢，說明窖泥微生物在發(fā)酵過程中經(jīng)過窖泥環(huán)境的選擇，逐漸淘汰了不適應該發(fā)酵環(huán)境的微生物，窖泥中不同位置的微生物分布整體趨于穩(wěn)定并集中到某些優(yōu)勢菌群中。

群落結(jié)構(gòu)或稱為“生物群落”，指的是生態(tài)學中，在一個群落生物環(huán)境內(nèi)相互之間具有直接或者間接關(guān)系的所有生物或者生物的總和。微生物群落中各種群之間是相互作用的，能以有規(guī)律的方式共處，具有各自明顯的營養(yǎng)和代謝類型。高通量測序結(jié)果顯示，樣本中共檢測出了62 個綱，671個屬。金徽60 年、30 年以及四川某酒廠30 年、10年的老窖中細菌在綱水平以Clostridia 為主，其含量隨著使用時間的延長而遞增。

樣品JH0202中Bacteroidia含量超過Clostridia，可能是部分窖泥鈣化，鏟除后用窖底泥拌和封窖泥修補導致。

圖2 樣品的Venn圖

對于四川人工窖泥CX03 而言，窖泥在室外發(fā)酵且用塑料布覆蓋密封，表層暴露于空氣中進行有氧或微氧發(fā)酵，菌種以好氧菌及兼性厭氧菌為主；窖泥中層隨著底層窖泥發(fā)酵氣體的溢出和本層氧氣的消耗，一些厭氧菌逐步成為優(yōu)勢菌群；底層窖泥在發(fā)酵過程中受地溫影響較大，發(fā)酵最快，接觸空氣最少，最先形成厭氧優(yōu)勢菌群。人工窖泥發(fā)酵過程中各層次差異較大，取樣既要保證代表性，又要具有廣泛性，因此取表層以下40 cm 處為檢測樣，測得結(jié)果是以Bacilli為優(yōu)勢菌群。

根據(jù)圖3 數(shù)據(jù)分析得出，老車間優(yōu)質(zhì)窖泥含有較高的綱為Clostridia，平均含量大于40%，主要為。新車間窖泥、人工老窖泥以及退化窖泥中以Bacilli 和Bacteroidia 為主，人工窖泥菌種分布隨發(fā)酵層次變化而變化，新窖及退化窖泥中以為主。江南大學胡曉龍等研究表明，退化窖泥中的Bacilli 綱中的、及含量高于優(yōu)質(zhì)窖泥中的含量，而Bacteroidia、Clostridia、Methanobacteria、Methanomicrobia、Synergistia 及Thermoplasmata 綱中屬的含量低于優(yōu)質(zhì)窖泥的含量。

圖3 窖泥樣品中原核生物綱水平組成

根據(jù)高通量測序結(jié)果，對綱水平上相對豐度前30 位的菌綱進行分析，如圖3 所示，樣品CX01 中主要有Clostridia（66.81 %）和Bacteroidia（17.53 %）；樣品CX02 中主要有Clostridia（56.37%）、Alphaproteobacteria（15.27%）、Bacteroidia（12.62%）和Bacilli（11.08 %）；樣品CX03 中主要有Bacilli（37.42 %）和Clostridia（37.14%）；樣品JH0101 中主要有Clostridia（38.92 %）、Gammaproteobacteria（19.24 %）、Bacteroidia（13.67 %）和Bacilli（14.91 %）；樣品JH0102中主要有Clostridia（52.52 %）、Bacilli（16.85 %）和Bacteroidia（16.40 %）；樣品JH0201中主要有 Clostridia（59.04 % ）和 Bacteroidia（35.15 %）；樣品JH0202 中主要有Bacteroidia（52.21%）和Clostridia（44.30%）；樣品JH0203 中主要有Clostridia（45.13%）、Bacilli（28.97%）和Bacteroidia（17.65 %）；樣品JH0204 中主要有Bacteroidia（46.58 % ）、Clostridia（22.44 % ）和 Bacilli（13.51 %）；樣品JH0205 中主要有Bacilli（43 %）、Bacteroidia（19.82 %）和Clostridia（19.19 %）；樣品JH0206 中主要有Clostridia（52.10 %）和Bacteroidia（31.05%）。

根據(jù)高通量測序結(jié)果，對屬水平上相對豐度前30 位的菌屬進行分析，如圖4 所示，樣品CX01中主要有（10.82 %）和（6.32%）；樣品CX02 中主要有（40.58 %）和（3.21 %）；樣品CX03中主要有（7.12 % ）、（7.7 %）、（5.07 %）、___12（4.30 %）和（2.96 %）；樣品JH0101 中主要有（9.78%）、（9.22 %）和（8.87 %）；樣品JH0102 中主要有（12.96 %）、___12（7.47 %）和（4.97 %）；樣品JH0201 中主要有（15.92 %）、（11.41 %）、（9.20 % ）和（7.70 %）；樣品JH0202 中主要有（33.00%）、（21.58%）和（13.05 %）；樣品JH0203 中主要有（28.38 %）和（11.85 %）；樣品JH0204 中主要有（32.35%）、（11.42%）和（3.08%）。

圖4 窖泥樣品中原核生物屬水平組成

3 結(jié)論

本試驗通過對不同地區(qū)的窖泥樣品進行高通量分析對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

（1）20 個樣品可劃分的OTU 數(shù)相差較大，兩者共有OTU 數(shù)僅為32 個。金徽60 年老窖池的樣品可劃分的OTU 數(shù)相差不大，兩者共有OTU 數(shù)為718 個，樣品JH0101 及JH0102 獨有的OTU 數(shù)分別為698 個和389 個。四川某酒廠的樣品可劃分的OTU 數(shù)相差較大，三者共有OTU 數(shù)為311 個，樣品CX02 及CX03 可劃分的OTU 數(shù)相差相對較大。金徽30 年老窖池的樣品可劃分的OTU 數(shù)相差不大，三者共有OTU 數(shù)為331 個，樣品JH0201、JH0202及JH0203獨有的OTU數(shù)分別為375個、225個和342個。

（2）就chao1 指標而言，樣品JH0101 豐富程度最好，樣品CX03 和CX01 次之。Shannon 指標和Simpson 指標數(shù)值為樣品CX03 最強，表明該樣品菌群多樣程度最好，其次是樣品JH0101 和JH0201。樣品JH0101 窖齡最大，在糟醅長期循環(huán)發(fā)酵過程中，窖泥中各種微生物之間共生、互生、競爭與寄生關(guān)系穩(wěn)定，達到了一個動態(tài)平衡的微生態(tài)環(huán)境，豐富度較高。CX03 為四川某酒廠人工培養(yǎng)窖泥，露天的發(fā)酵環(huán)境為微生物多樣性創(chuàng)造了基本條件。窖泥由外向內(nèi)分為好氧菌、微好氧菌、兼性厭氧菌、厭氧菌和嚴格厭氧菌五大類，底部人工窖泥微生物結(jié)構(gòu)與窖池中窖泥微生物結(jié)構(gòu)相似，中上層出現(xiàn)明顯差異，上層與空氣接觸部分人工窖泥微生物結(jié)構(gòu)與窖泥完全不同。黃治國等在2014年發(fā)布報道，系統(tǒng)分析研究了窖泥中的古菌，證明古菌隨窖齡的增加而增加，窖底含量高于窖壁。古菌與窖底細菌可能存在的共生、互生關(guān)系是形成窖泥微生物多樣性的重要因素。古菌為自養(yǎng)、異養(yǎng)型菌生長緩慢，細菌為異養(yǎng)型菌生長迅速。二者之間的關(guān)系可能是老窖泥中微生物豐富度高，人工窖泥中微生物多樣性程度高的重要原因。

（3）根據(jù)Beta 多樣性從主成分上分析可知，60年窖池中各部位群落相似度比較高，10年及人工窖泥中群落相似性較低。基于UniFrac 距離的NMDS非度量多維尺度分析發(fā)現(xiàn)，10年窖池各樣品距離較近，群落結(jié)構(gòu)相似度高，60 年窖池樣品群落結(jié)構(gòu)差異顯著。基于UniFrac 距離的多組比較箱線圖分析發(fā)現(xiàn)，各個組之間的差異十分顯著；各個組內(nèi)相比較來說，相同窖齡的差別并不顯著，窖齡不同的差別最為顯著。

（4）從菌落分布圖可看出，在綱水平菌落分布圖中，無論在哪個樣品中，Clostridia 都占有絕對優(yōu)勢。從屬水平分析，老窖中各菌種占比均不高，含量相對較高，其他菌屬占有一定比例；新窖和人工窖泥中含量相對較高，其他菌種占比較少。從整體分析，窖泥中微生物分布及豐富度與窖齡有緊密的聯(lián)系，具體的關(guān)系有待進一步研究。