HLA-G 通過促進活化性受體的表達增強NK 細胞對宮頸癌細胞的殺傷作用

劉 倩，哈提拉·吐爾遜，阿仙姑·哈斯木

（新疆醫科大學基礎醫學院，新疆地方病分子生物學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054）

全世界范圍內，女性宮頸癌的發病率位居第4，僅次于乳腺癌、結直腸癌和肺癌。其中三分之一以上病例出現在中國和印度[1]。在中國，由于缺乏廣泛的篩查，宮頸癌仍然是中低等收入地區婦女的常見生殖系統惡性腫瘤[2]。

研究表明，人類白細胞抗原G （HLA-G）是孕婦對胎兒提供免疫耐受的中心蛋白，在腫瘤組織中，HLA-G 表達顯著升高[3]。在乳腺癌、胰腺癌以及卵巢癌細胞中過表達HLA-G 可抑制NK 細胞的殺傷，HLA-G 表達水平降低可恢復NK 細胞對腫瘤細胞的殺傷[4]。許多研究表明，HLA-G 及其受體可能是腫瘤免疫治療中重要的檢查點[5]。

自然殺傷（natural killer，NK）細胞是機體抵抗腫瘤的重要屏障，與淋巴細胞不同，NK 細胞不需要特異性抗原致敏，可通過分泌γ-干擾素（interferon-γ，IFNγ），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等細胞因子介導細胞毒性作用[6]。多項研究表明，NK 細胞可通過多種途徑發揮強大的抗腫瘤作用。NK 細胞表達一系列免疫受體，以識別靶細胞上的相關配體，維持NK 細胞活化與耐受之間的免疫平衡[7]。NK 細胞對靶細胞的殺傷依賴于NK 細胞表面活化性受體的上調，繼而釋放穿孔素（Granzyme）、顆粒酶（Perforin）等殺傷介質，發揮抗腫瘤作用。腫瘤細胞可以通過劫持這些受體-配體系統來破壞免疫細胞介導的細胞溶解來逃避免疫監視[8]。研究表明，HLA-G 可作為配體抑制NK 細胞上表達的活化性受體，可直接降低NK 細胞的腫瘤殺傷能力[9]。然而，在NK 細胞的活化性受體中，NKG2D、NKP30 已被深入研究，但其表達水平與NK 細胞對宮頸癌細胞殺傷的影響報道較少。

本研究擬在宮頸癌細胞及正常宮頸上皮細胞中檢測HLA-G 的表達差異，并進一步探討HLAG 如何影響NK 細胞對宮頸癌細胞的殺傷能力，HLA-G 及其活化性受體NKG2D、NKP30 是否可作為新的宮頸癌免疫檢查點，以期為宮頸癌免疫治療新的靶點發現提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 宮頸癌細胞株培養，構建HLA-G 穩定低表達細胞株

本課題所使用的宮頸癌細胞系C33a（HPV16+）、SiHa（HPV16-），正常宮頸上皮細胞H8 均購自普諾賽（武漢）細胞庫。3 種細胞系培養基一致，DMEM 中加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素、鏈霉素混合物。細胞在37 ℃、5% CO2條件下，放入細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific，美國）中培養。每隔2 d 更換培養基并在顯微鏡下觀察細胞狀態。

將C33a、SiHa 接種至6 孔板中，待細胞長至40%時，將HLA-G 穩定低表達慢病毒載體（吉凱，上海）加入細胞上清液中，感染宮頸癌細胞（shHLA-G-C33a，shHLA-G-SiHa）。約20 h 后加入含嘌呤霉素（1 μg/mL）的培養基培養5～7 d，后加入含嘌呤霉素（0.5 μg/mL）的培養基繼續維持濃度，進行擴大培養并收集蛋白，采用WB 法進行轉染效率的檢測。

1.2 實時定量PCR（real-time PCR）

使用Trizol（索萊寶，北京）從C33a、SiHa 及H8 細胞株中提取RNA，并進行RNA 濃度及純度檢測，確保RNA 溶液的A260/A280 的范圍在1.8～2.1 之間。按照說明書描述，將RNA 逆轉錄為cDNA。然后對HLA-G 的引物（生工生物，上海）（表1）進行PCR 擴增（SYBR Green PCR Kit，天根，北京雅安達生物）。用Ct 值計算HLA-G mRNA 相對表達水平，以GAPDH 的表達量作為內參。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

1.3 免疫印跡法（western-blot WB）

檢測C33a、SiHa、H8 細胞株及shHLA-G-C33a，shHLA-G-SiHa 穩轉株中HLA-G 蛋白的相對表達量。棄培養基，用PBS 溶液將培養好的貼壁細胞漂洗2～3 遍，用預冷的RIPA 裂解液（索萊寶，北京）裂解細胞株中的總蛋白，刮落細胞，轉移至EP 管，用Bradford 法測定上清中蛋白濃度。采用SDS-PAGE 法，取20～30 μg 蛋白進行電泳，采用槽式濕轉法轉移至PVDF 膜，封閉，加入兔抗人HLA-G 多克隆抗體（1∶500）（Abcam 美國），于4 ℃搖床過夜，洗滌后加入抗兔二抗（1∶2 000），加入5%脫脂奶粉室溫孵育2 h。以GAPDH（碧云天生物，上海）為內參。

1.4 NK 細胞分選，NK 細胞與宮頸癌細胞共培養

取正常婦女抗凝外周全血累計20 mL，利用淋巴細胞分離液提取單個淋巴細胞，后用PBS 漂洗2 遍。將離心好的沉淀中加入250 μLCD56+磁珠（BD 美國），避光靜置30 min。后加入2 mL 的PBS，用移液器吹勻，放置于磁力架上，避光放置10 min，吸出管中上清液，吸取干凈后，加入1 mL PBS，重復上述操作并棄去上清。加入培養基，放入細胞培養瓶中過夜培養。調整細胞濃度為1×106個/mL，培養備用。流式細胞儀檢測NK 細胞純度為93.53%（圖1）。

圖1 NK 細胞流式純度檢測Fig.1 Purity detection of NK cells by flow cytometry

實驗共培養細胞共分為6 組：（1）C33a 組，（2）C33a+NK 組，（3）shHLA-G-C33a+NK 組，（4）SiHa 組，（5）SiHa+NK 組，（6）shHLA-G-SiHa+NK 組。細胞共培養效靶比為1∶10，培養48 h后，收取細胞用于后續檢測。

1.5 細胞增殖檢測（CCK8）

采用CCK8 法檢測共培養后C33a 和SiHa 細胞增殖的改變，將對數生長期的C33a 和SiHa 細胞接種于96 孔板。再加入分選的NK 細胞干預48 h 后吸出懸浮的NK 細胞后，各孔加入10 μL的CCK8 工作液（博奧森，北京），將96 孔板置于含5% CO2的37 ℃培養箱中避光孵育4 h。用酶標儀于450 nm 處測定各孔的吸光度（OD）值。

1.6 細胞凋亡

收集1～5×105細胞，PBS 洗滌2 遍。離心后加入0.5 mL 的Binding Buffer（BD 美國）懸浮細胞。加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 混勻后，再加入5 μL PI，混勻。室溫避光反應5～15 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡狀況。

1.7 流式細胞術

與宮頸癌細胞共培養48 h 后，收集懸浮的NK 細胞，PBS 漂洗2 遍，分別加入流式抗體NKG2D、NKP30、Granzyme、perforin（Thermo Fisher Scientific，美國）后，用流式細胞儀進行檢測。采用FlowJo 分析軟件10.8.1 進行數據分析。

1.8 統計學處理

采用IBM SPSS 21.0 軟件及Graphpad Prism 5對所有實驗數據進行統計學分析。計量資料服從正態分布采用均數±標準差描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩多重比較采用Dunnett 法，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HLA-G 在宮頸癌細胞株中的表達高于正常宮頸上皮細胞

RT-PCR 檢測結果顯示：3 組間表達差異有統計學意義（F=25.870，P=0.010），與H8（1±0.061）細胞系相比，HLA-G 在C33a 細胞（1.294±0.068）及SiHa 細胞（1.411±0.045）中的表達明顯增高（P＜ 0.05），C33a 與SiHa 間的表達差異無統計學意義（P=0.263），見圖2A。

WB 檢測結果顯示：3 組間表達差異有統計學意義（F=1 455，P＜ 0.001），與H8（1±0.000）細胞系相比，HLA-G 在C33a 細胞（1.373±0.030）及SiHa 細胞（3.101±0.065）中的表達明顯增高（P＜0.05），C33a 與SiHa 間的表達差異有統計學意義（P＜ 0.001），圖2B。

圖2 HLA-G 在宮頸癌及正常宮頸上皮細胞系中的表達差異Fig.2 Difference in HLA-G expression between cervical cancer and normal cervical epithelial cell lines

2.2 宮頸癌細胞系C33a 和SiHa 細胞慢病毒轉染后HLA-G 蛋白表達水平降低

WB 檢測結果顯示，C33a 細胞中，4 組間表達差異有統計學意義（F=29.980，P＜ 0.05），HLAG 在C33a 細胞中NC 組（0.109±0.028）的表達量顯著高于shHLA-G-1 組（0.037±0.003）、shHLA-G-2 組（0.021±0.004）及shHLA-G-3 組（0.007±0.001）（P＜ 0.05），見圖3A。SiHa 細胞中，4 組間表達差異有統計學意義（F=30.890，P＜0.05），HLA-G在NC 組（0.372±0.055）中的表達明顯高于shHLAG-1 組（0.219±0.016）、shHLA-G-2 組（0.160±0.013）及shHLA-G-3 組（0.092±0.016）（P＜ 0.05），見圖3B。2 株細胞檢測結果一致。

圖3 慢病毒轉染宮頸癌細胞系后HLA-G 表達情況Fig.3 HLA-G expression after transfection in cervical cancer cell lines

2.3 HLA-G 下調后促進人外周血NK 細胞對宮頸癌細胞的殺傷

HLA-G 下調后，NK 細胞與C33a 及SiHa 細胞共培養，CCK8 法檢測共培養后腫瘤細胞增殖能力，結果顯示：C33a 細胞中，3 組間差異有統計學意義（F=707.300，P＜ 0.001），與C33a 細胞株（1.916±0.046）相比，C33a+NK 組（1.453±0.054）及shHLA-G-C33a+NK（0.747±0.039）組細胞增殖能力明顯減弱（P＜ 0.001），且C33a+NK 組與shHLA-G-C33a+NK 間差異有統計學意義（P＜0.001），見圖4A。同樣的，SiHa 細胞中，3 組間差異有統計學意義（F=682.400，P＜ 0.001），與SiHa 細胞株（1.943±0.032）相 比，SiHa+NK 組（1.095±0.048） 及 shHLA-G-SiHa+NK（0.472±0.071）組細胞增殖能力明顯減弱（P＜ 0.001），且SiHa+NK 組與shHLA-G-SiHa+NK 間差異有統計學意義（P＜ 0.001），見圖4B。

圖4 CCK8 法檢測各組宮頸癌細胞增殖能力Fig.4 CCK8 was used to detect the proliferation of cervical cancer cells

HLA-G 下調后，NK 細胞與C33a 及SiHa 細胞共培養，流式細胞術檢測共培養后腫瘤細胞凋亡程度，結果顯示：C33a 細胞中，3 組間差異有統計學意義（F=348.100，P＜ 0.001），與C33a 細胞株（3.153±0.360）%相比，C33a+NK 組（7.130±1.404）%及shHLA-G-C33a+NK（23.050±0.873）%組細胞凋亡水平明顯 增 加（P＜ 0.05），且C33a+NK 組 與shHLA-G-C33a +NK 間差異有統計學意義（P＜ 0.001），見圖5A。SiHa 細胞株中，3 組間差異有統計學意義（F=21.310，P=0.002），與SiHa 組（4.330±1.564）%相 比，SiHa+NK 組（15.240±1.804）%凋亡水平存在升高趨勢，但差異無統計學意義（P=0.061），shHLA-G-SiHa+NK（28.810±7.603）%組細胞凋亡水平明顯升高（P=0.002），且SiHa+NK 組 與shHLA-G-SiHa+NK 間差異有統計學意義（P=0.026），見圖5B。

圖5 HLA-G 下調后NK 細胞與C33a 及SiHa 細胞共培養，腫瘤細胞凋亡程度Fig.5 After HLA-G transfection，NK cells were co-cultured with C33a and SiHa cells，detection the degree of apoptosis of tumor cells

2.4 HLA-G 下調促進NK 細胞表面激活性受體NKG2D、NKP30 的表達

HLA-G 下調后，NK 細胞與C33a 及SiHa 細胞共培養，流式細胞術檢測共培養后NK 細胞表面NKG2D 的表達，結果顯示：C33a 細胞中，3組間差異有統計學意義（F=70.160，P＜ 0.001），與NK 組（1.840±0.505） %相 比，NK+C33a 組（6.557±3.278）%存在升高趨勢，但差異無統計學意義（P=0.083），而NK+shHLA-G-C33a 組（22.790±2.121）%NKG2D 表達率明顯升高（P＜ 0.001），且NK+C33a 組與NK+shHLA-G-C33a 組間差異有統計學意義（P＜ 0.001）。SiHa 細胞中，3 組間差異有統計學意義（F=153.200，P＜ 0.001），與NK 組（1.840±0.505）%相比，NK+SiHa 組（11.560±1.376）%及NK +shHLA-G-SiHa 組（20.600±1.739）% NKG2D表達率明顯升高（P＜ 0.05），且NK+SiHa 組與NK+shHLA-G-SiHa 組間差異有統計學意義（P＜0.001），見圖6A。

流式細胞術檢測共培養后NK 細胞表面NKP30 的表達，結果顯示：C33a 細胞中，3 組間差異有統計學意義（F=123.500，P＜ 0.001）。與NK 組（7.047±1.242）%相比，NK+C33a 組（11.470±0.185）%及NK+shHLA-G-C33a 組（19.050±1.053）%NKP30 表達率明顯升高（P＜ 0.05），且NK+C33a組與NK+shHLA-G-C33a 組間差異有統計學意義（P＜ 0.001）。SiHa 細胞中，3 組間差異有統計學意 義（F=10.550，P=0.011），與NK 組相比，NK+SiHa 組（12.770±0.529）%NKP30 表達率存在升高趨勢，但差異無統計學意義（P=0.236），而NK+shHLA-G-SiHa 組（21.240±6.455） %NKP30表達率顯著升高（P=0.009），NK+SiHa 組與NK+shHLA-G-SiHa 組間差異無統計學意義（P=0.077），見圖6B。

流式細胞術檢測共培養后Granzyme 的表達結果顯示：C33a 細胞中，3 組間差異有統計學意義（F=33.170，P=0.001），與NK 組（14.700%±1.455） %相 比，NK+C33a 組（16.350±2.528） %Granzyme 的表達水平存在升高趨勢，但差異無統計學意義（P=0.689），而NK+shHLA-G-C33a 組（29.110±2.894）%Granzyme 表達率顯著升高（P=0.001），且NK+C33a 組與NK+shHLA-G-C33a 組間差異有統計學意義（P=0.001）。SiHa 細胞中，3 組間差異有統計學意義（F=6.881，P=0.028），與NK 組相比，NK+SiHa 組（20.330±0.998）%Granzyme 表達率略升高，而NK+shHLA-G-SiHa組（29.840±8.568）%Granzyme 表達率顯著升高（P=0.024），而NK+SiHa 組與NK+shHLA-GSiHa 組間差異無統計學意義（P=0.131），見圖6C。

流式細胞術檢測共培養后Perforin 的表達，結果顯示：C33a 細胞中，3 組間差異有統計學意義（F=20.81，P=0.002），與NK 組（17.330±0.503）%相比，NK+C33a 組（20.170±3.947）%Perforin 的表達水平存在升高趨勢，但差異無統計學意義（P=0.562），而NK+shHLA-G-C33a 組（33.280±3.935）%Perforin 表達率顯著升高（P=0.002），且NK+C33a 組與NK+shHLA-G-C33a 組之間表達差異有統計學意義（P=0.006）。SiHa 細胞中，3 組間差異有統計學意義（F=9.921，P=0.01），與NK 組相比，NK+SiHa 組（24.530±0.806）% Perforin 表達率存在升高趨勢，但差異無統計學意義（P=0.152），而NK+shHLA-G-SiHa 組（31.980±6.910）%Perforin 表達率顯著升高（P=0.010），而NK+SiHa 組與NK+shHLA-G-SiHa 組間差異無統計學意義（P=0.152），見圖6D。

圖6 HLA-G 下調后，NK 細胞與宮頸癌細胞共培養，NK 細胞表面激活性受體及殺傷介質的表達Fig.6 After HLA-G transfection，NK cells were co-cultured with cervical cancer cells，the expression of NK cell surface activating receptor and killing agent was observed

3 討論

全世界范圍內，女性宮頸癌發病率位居第4，占所有女性惡性腫瘤的6.6%，因此是一個重大的全球健康挑戰，約90%的宮頸癌死亡病例發生在經濟欠發達地區。盡管在過去十年中，有效篩查和預防性疫苗接種取得了重大進展，但晚期宮頸癌仍然缺乏有效的治療策略。因此，新的治療策略，如免疫治療的研究迫在眉睫。

HLA-G 的表達最初在母胎界面的細胞滋養層細胞上被發現，HLA-G 可調節母親免疫細胞的反應，有助于維持對胎兒的免疫耐受[10]。多年來，許多學者研究了HLA-G 在不同類型惡性腫瘤中的表達水平，表明多種惡性腫瘤HLA-G 表達升高，其中包括口腔鱗癌[11]、結直腸癌[12]和乳腺癌[13]等。許多研究表明，HLA-G 在惡性腫瘤中的表達與患者不良的臨床結局相關，提示HLAG 在惡性腫瘤進展中發揮重要作用。在宮頸癌中HLA-G 同樣發揮促進腫瘤惡性轉化的作用，姜等[14]的研究中發現，HLA-G 的表達水平越高，宮頸癌組織分化程度越差。在本研究中，以H8細胞作為陰性對照組，從mRNA、蛋白2 種水平分別在C33a 及SiHa 細胞系中檢測HLA-G 的表達水平，結果表明，HLA-G 在宮頸癌細胞中表達水平顯著升高。結果與文獻中報道的基本一致，說明宮頸癌的發生與HLA-G 的表達水平呈正相關，它的表達升高可能使患者發生宮頸癌的風險增加。Dong 等[15]的研究發現，與未感染HPV 的CIN 患者相比，HPV16/18 感染的CIN 和宮頸癌患者的HLA-G 表達顯著升高。本研究中，mRNA水平和HLA-G 在C33a、SiHa 細胞中的表達存在上升趨勢，但差異無統計學意義，而蛋白水平，SiHa 細胞中HLA-G 的表達明顯高于C33a，且差異有統計學意義，說明HLA-G 蛋白的表達水平升高可能與HPV16 感染密切相關，本研究選用兩株宮頸癌細胞系，而Dong 等的研究對象為患者組織樣本，且陽性對照組為CIN 組織，研究樣本的不同，可能是造成結果不一致的原因。值得注意的是，本研究中轉錄水平和蛋白水平的檢測結果不完全一致，課題組分析，從HLA-G 基因到蛋白發揮功能有可能存在各種未知的調控機制，因此，HLA-G 在宮頸癌中的是否能與高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）協同促進宮頸癌發生發展及具體的調控機制，課題組將進一步深入研究。

HLA-G 可通過介導抗原遞呈來影響宿主的免疫反應。HLA-G 在腫瘤細胞中的表達升高，可能使它們逃脫宿主的免疫監視[16]。幾項體外研究表明，與腫瘤細胞相比，HLA-G 下調的白血病、膠質瘤、卵巢癌和肝細胞癌細胞株被NK 細胞更有效地殺死。也有研究報道，用HLA-G 抗體可阻斷NK 細胞介導的靶向癌細胞株的裂解，表明HLA-G 的高表達促進腫瘤細胞逃脫宿主的免疫監視[3]。當腫瘤細胞缺乏HLA-G 的表達時，可通過激活性受體的上調激發NK 細胞對腫瘤細胞的殺傷，殺傷激活性受體主要包括NKG2D、NCR（NKP30、NKP44、NKP46）及CD226，其中NKG2D是具有細胞外凝集素樣結構域的跨膜蛋白，它是NK 細胞表面的主要激活性受體[17]。Guerra 等[18]的體內研究發現，敲除NKG2D 基因后，腫瘤體積明顯增大，這是首次在基因水平證明NKG2D在惡性腫瘤中的重要免疫監視作用。徐等[19]的研究發現，在肺癌中，NKG2D 與其配體結合后，可激活NK 細胞，誘導機體的抗腫瘤免疫應答。本課題組在宮頸癌C33a 及SiHa 兩株細胞中均發現HLA-G 的表達水平與NK 細胞表面NKG2D 表達水平呈負相關，說明HLA-G 作為NKG2D 的配體，它的下調促進了NK 細胞對宮頸癌細胞的殺傷裂解。此外，NK 細胞還可表達天然細胞毒性受體NKP30，它與其配體HLA-G 的結合將一種強烈的激活信號傳遞給NK 細胞，介導NK 細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。Pende 等[20]的工作首次鑒定了NKP30，證明了該受體在惡性腫瘤細胞裂解中發揮重要作用。研究表明，NKP30 的表達與機體主動清除腫瘤細胞的能力直接相關，相反，降低NKP30 的活性，可一定程度的避免NK 細胞對腫瘤細胞的殺傷裂解，同時，NKP30 表達不足與惡性腫瘤患者的不良預后密切相關[21]。Banu等[22]的研究發現，用可溶性NKP30 刺激宮頸癌細胞可降低細胞增殖和遷移能力。本研究在C33a 細胞中發現，HLA-G 下調后，NKP30 的表達升高。而在SiHa 細胞系中HLA-G 下調后，NKP30 的表達有上升趨勢，但差異無統計學意義，說明NKP30 的表達可能會一定程度的受到HPV病毒的影響，但具體影響機制還需進一步研究。因此，課題組認為HLA-G 與NKG2D 有望成為宮頸癌免疫治療新的聯合靶點，而HLA-G 與NKP30 是否可以成為宮頸癌免疫治療的聯合靶點，有待進一步深入研究。

大量文獻表明，NK 細胞可通過釋放含有Granzyme 的細胞毒性顆粒或接觸啟動Caspase 級聯反應的死亡受體來消除腫瘤細胞。Granzyme 一旦被釋放，在Perforin 的幫助下會被運送到靶細胞的細胞質中，對靶細胞進行殺傷[23]。值得注意的是，本研究中，采用WB 法檢測HLA-G 的表達差異，發現與H8 細胞相比，HLA-G 在C33a及SiHa 細胞中的表達明顯升高，且C33a 及SiHa細胞中HLA-G 的表達存在顯著性差異。同樣的，在經處理的C33a 及SiHa 細胞中NKG2D 的表達差異均有顯著性差異，提示HLA-G 作為癌基因，可能與HPV16 感染協同促進腫瘤生成，同時通過抑制NK 細胞表面活化性受體NKG2D 的表達，促進腫瘤免疫逃逸的發生。進一步研究發現，以C33a 細胞為研究對象，HLA-G 基因干擾前后NKP30、Granzyme、Perforin 的表達差異均有統計學意義，而以SiHa 細胞為研究對象，HLA-G 基因干擾前后NKP30、Granzyme、Perforin 的表達差異均無統計學意義。因此，NKP30 能否作為免疫檢查點有待課題組進一步研究。

本研究已經在NK 細胞的特性和觸發機制的探索方面取得了部分進展，研究的目的是通過靶向NK 細胞受體和癌細胞標記物來觸發NK 細胞對癌細胞的溶解反應。研究這些受體的基本作用，對于開發阻礙HLA-G 功能的免疫檢查點抑制劑具有重要意義，HLA-G 及其激活性受體NKG2D可能成為腫瘤免疫治療中免疫阻斷的靶點。