普魯卡因通過調控TLR4/NF-κB通路對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的影響

劉思遠，于明帥，張 科

常見的心血管疾病有冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化和心臟病等，具有高發病率和高死亡率的特點，心肌缺血再灌注引起的心肌損傷是心血管疾病的主要誘因，因此，如何有效減緩心肌細胞缺血再灌注引起的細胞損傷是當前醫學研究的熱點[1-2]。心肌細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應作為心肌細胞缺氧/復氧(H/R)誘導的心肌損傷機制[3]。普魯卡因(procaine，PCA)是一種局部麻醉的氨基酯類藥物，具有毒性小、麻醉效果好和價格便宜等優點[4]。有研究顯示，PCA可以通過上調熱休克蛋白27(HSP27)促進過氧化氫誘導的心肌細胞增殖，抑制心肌細胞凋亡，減緩心肌細胞的氧化損傷[5]。有研究結果顯示，Toll樣受體4(TLR4)/核轉錄因子-κB(NF-κB)信號可能參與心肌細胞H/R誘導的細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應[6]。蔡智慧等[7]研究結果顯示，梔子苷可以通過抑制TLR4/NF-κB通路減緩H/R誘導的大鼠心肌細胞炎性損傷。因此，本研究通過H/R誘導心肌細胞建立模型，探討PCA是否可以通過TLR4/NF-κB通路影響H/R誘導的心肌細胞活力、凋亡、氧化應激和炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 大鼠H9c2心肌細胞，購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、高糖DEME培養基，購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；鹽酸普魯卡因注射液，購自江蘇悅興藥業有限公司，規格：50 mg(20 mL)，批準文號：國藥準字H32024570；NF-κB通路抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)，購自美國Sigma-Aldrich公司；Bcl-2抗體、Bax抗體、TLR4抗體、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)p65抗體、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)抗體、NF-κB p65抗體、NF-κB抑制蛋白(IκBα)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體，購自美國Santa Cruz公司；凋亡試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；白細胞介素-1β(IL-1β)試劑盒、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 培養細胞和分組 取出H9c2心肌細胞在含有胎牛血清、雙抗(1%青霉素-鏈霉素)的高糖DEME培養基內進行培養，且培養箱條件設置為37 ℃、5% CO2、95%N2。每隔2 d換一次培養基，待細胞生長至85%后進行傳代培養。

取對數生長期的H9c2心肌細胞，然后將細胞分組，對照組(Con組)在培養箱內正常培養細胞；H/R組在95% N2和5% CO2的培養箱內培養4 h，然后在正常條件下培養6 h；PCA低劑量組(H/R+PCA-L組)、PCA中劑量組(H/R+PCA-M組)、PCA高劑量組(H/R+PCA-H組)分別采用濃度為3.50 mg/L、7.00 mg/L、14.00 mg/L的PCA處理細胞，30 min后參照H/R組培養條件，進行H/R處理細胞。H/R+PCA組、H/R+PCA+PDTC組分別采用14.00 mg/L PCA及5 μmol/L NF-κB通路抑制劑PDTC處理細胞，之后進行H/R處理。

1.3 MTT檢測細胞活力 取對數生長期的H9c2心肌細胞，胰蛋白酶消化后制備細胞懸液，調整細胞密度，取100 μL添加至96孔板內，每孔加入相應的MTT試劑20 μL，培養箱內孵育4 h，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)試劑。然后采用酶標儀在490 nm處檢測各組細胞的吸光度值，計算細胞活力。

1.4 流式細胞術實驗檢測細胞凋亡 取對數生長期的H9c2心肌細胞，調整密度后添加至6孔板內，每孔內2×105個細胞，置入培養箱內孵育24 h。加入胰酶消化重懸細胞，離心倒去上清液。每孔加入相應的5 μL磷酯酰絲氨酸熒光素(AnnexinV-FITC)和10 μL碘化丙啶(PI)試劑，室溫下反應20～30 min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 蛋白質免疫印跡法(Western Blot)檢測Bcl-2、Bax和TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白的表達 取對數生長期的H9c2心肌細胞用于提取各組細胞的總蛋白，經過BCA試劑檢測定量蛋白的濃度。在蛋白加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸變性10 min后，經過SDD-聚丙烯酰胺(PAGE)分離處理，轉膜，封閉，加入稀釋的Bcl-2、Bax、TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα、NF-κB p65、IκBα一抗，孵育過夜，加入二抗，孵育1 h后，加入增強電化學發光法(ECL)顯影。以GAPDH為內參，通過Image J軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。

1.6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測LDH、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α表達 取對數生長期的H9c2心肌細胞，2 500 r/min離心10 min后，收集各組細胞的上清液，然后采用LDH試劑盒、MDA試劑盒、IL-1β試劑盒、IL-6試劑盒和TNF-α試劑盒檢測LDH、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，嚴格按照說明書步驟進行。

2 結 果

2.1 PCA對H/R誘導的心肌細胞活力和凋亡的影響 與Con組比較，H/R組細胞活力、Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+PCA-L組、H/R+PCA-M組、H/R+PCA-H組細胞活力、Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax蛋白表達明顯降低(P<0.05)。詳見圖1和表1。

圖1 PCA對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響(A為流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率；B為各組凋亡相關蛋白表達條帶圖)

表1 各組心肌細胞活力、細胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達比較

2.2 PCA對H/R誘導的心肌細胞氧化應激的影響 與Con組比較，H/R組LDH、MDA明顯增加(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+PCA-L組、H/R+PCA-M組、H/R+PCA-H組LDH、MDA明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組LDH、MDA水平比較

2.3 PCA對H/R誘導的心肌細胞炎癥反應的影響 與Con組比較，H/R組IL-1β、IL-6、TNF-α明顯增加(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+PCA-L組、H/R+PCA-M組、H/R+PCA-H組IL-1β、IL-6、TNF-α明顯降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 單位：pg/mL

2.4 PCA對H/R誘導的心肌細胞TLR4/NF-κB通路的影響 與Con組比較，H/R組TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+PCA-L組、H/R+PCA-M組、H/R+PCA-H組TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達明顯降低(P<0.05)。詳見圖2及表4。

圖2 各組心肌細胞TLR4/NF-κB通路蛋白表達條帶圖

表4 各組心肌細胞TLR4/NF-κB通路蛋白表達比較

2.5 PCA通過調控TLR4/NF-κB通路對H/R誘導的心肌細胞活力、凋亡的影響 與H/R+PCA組比較，H/R+PCA+PDTC組細胞活力、Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax蛋白表達明顯降低(P<0.05)。詳見圖3及表5。

圖3 PCA通過調控TLR4/NF-κB通路對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響(A為流式細胞儀檢測兩組細胞凋亡率；B為凋亡相關蛋白表達條帶圖)

表5 兩組心肌細胞活力、細胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達比較

2.6 PCA通過調控TLR4/NF-κB通路對H/R誘導的心肌細胞氧化應激和炎癥反應的影響 與H/R+PCA組比較，H/R+PCA+PDTC組LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α明顯降低(P<0.05)。詳見表6。

表6 兩組心肌細胞氧化應激和炎性因子比較

3 討 論

心肌缺血再灌注是因為冠狀動脈阻塞、供血不足一段時間后，心肌重新恢復灌注引起的心肌細胞損傷，近年來，在我國心血管疾病病人發病年齡呈年輕化趨勢，受飲食習慣、吸煙、環境和精神等眾多因素的影響[8-9]。本實驗通過建立心肌細胞H/R模型，發現在H/R條件下，心肌細胞的活力受到抑制，細胞凋亡率、LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達減低，Bax蛋白表達增加，提示心肌細胞H/R模型構建成功。Bcl-2和Bax屬于Bcl-2家族的成員，在細胞凋亡的線粒體途徑中起著核心的作用，多種疾病中Bcl-2表達升高起到抗凋亡的作用，而Bax表達下調起到促凋亡的作用[10-11]。LDH是一種氧化還原酶，大多存在于腎臟器官中，其次是心肌組織和骨骼，LDH含量的高低可以反映氧化損傷的程度[12-13]。MDA在機體內抗氧化過程中具有重要作用，若機體內氧自由基大量增多，導致過氧化物含量增加，可以間接反映氧化損傷[14]。炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α參與多種細胞的炎癥反應，在H/R誘導的心肌細胞損傷中表達增加，在病理狀態下加重細胞的炎性損傷[15]。PCA作為一種局部麻醉藥，在多種抗腫瘤方面取得了明顯的作用效果[16]。本研究結果顯示，經過PCA處理細胞后，與H/R模型組比較，PCA各劑量組細胞活力明顯增加，細胞凋亡率、LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達降低，這說明PCA可以明顯減緩H/R誘導的心肌細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應，并提高細胞活力。

TLR4/NF-κB信號通路是心肌缺血再灌注損傷研究中經典的信號通路，TLR4異常激活后可以啟動MyD88蛋白表達增加進入細胞內，促進下游NF-κB蛋白的活化，促進炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6釋放，造成心肌細胞的炎性損傷[17-18]。TLR4、NF-κB在H/R誘導的心肌細胞中表達上調，抑制TLR4/NF-κB可以減緩H/R誘導的心肌細胞的凋亡和炎癥反應[19]。劉婷婷等[20]研究結果顯示，氧化苦參堿通過抑制NF-κB信號通路減緩H/R誘導的凋亡和氧化應激，起到保護心肌細胞的作用。花旗松素能夠抑制NF-κB信號通路減緩H/R誘導心肌炎性細胞浸潤明顯，抑制心肌細胞的凋亡[21]。本研究結果顯示，在H/R模型中，TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα在心肌細胞中表達上調，經過PCA處理后，PCA各劑量組TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達下調，說明PCA可以抑制TLR4/NF-κB通路表達。進一步實驗結果顯示，通過加入NF-κB通路抑制劑PDTC后，細胞活力明顯增加，而細胞凋亡率、LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α表達受到抑制，Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達減低，說明PCA通過抑制TLR4/NF-κB的表達發揮作用。

綜上所述，PCA能夠減緩H/R誘導的心肌細胞損傷，其作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關。