基于HMGB1炎癥通路的甘草炮制雷公藤降低肝毒性的作用機制研究Δ

馬致潔，董捷鳴，于小紅，李 萌，陳 熹，趙奎君，饒 全#，章從恩#

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院藥學部，北京 100050； 2.首都醫科大學附屬北京友誼醫院普外科，北京 100050)

雷公藤為衛矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)的干燥根，因其毒性較大，傳統以外用為主，不予內服，直至1974年首次將雷公藤內服用于治療類風濕關節炎[1]。雷公藤作為一味經典毒性中藥，古代醫籍中對其炮制方法的記載甚少，現代應用時以凈制為主，去除毒性較大的外皮，取毒性較小的木質入藥，但仍易出現不良反應以及藥物性中毒事件[2-3]。同時，隨著皮部有效成分的丟失，其有效性也受到影響。微生物發酵炮制時，微生物中的酶系與雷公藤中的成分發生一系列有機反應，容易改變原有成分或者增加一些新的毒性物質。在傳統發酵過程中，由于菌種的不確定性和有毒菌株的混入，難以保障發酵產品質量的均一性和安全性[4-5]。目前公認的炮制減毒方法是以輔料炮制，但在雷公藤炮制減毒方面的研究較少。近期國內學者也系統比較了不同炮制方法對雷公藤藥效和肝毒性的影響[6-9]。研究結果表明，在諸多炮制方法中，甘草汁炮制雷公藤增效減毒效果較佳，前期課題組已建立了甘草炮制雷公藤的方法，并證實了甘草炮制減毒的客觀性，但減毒機制仍未完全闡釋清楚[10-11]。

高遷移率族蛋白1(HMGB1)為存在于哺乳動物組織細胞核內的蛋白。HMGB1可由激活的免疫細胞或壞死細胞釋放至胞外，通過Toll樣受體4(TLR4)和鈣調節通道介導炎癥反應，參與免疫性疾病的發生[12-13]。在脂多糖/D-氨基半乳糖誘導的肝損傷中，HMGB1被釋放至胞外，激活樹突狀細胞，啟動適應性免疫應答[14-15]。課題組前期研究結果驗證了雷公藤致大鼠肝損傷的機制可能與其激活了HMGB1-TLR4/核因子κB(NF-κB)炎癥通路有關[16-17]。本研究繼續探討甘草制雷公藤降低肝毒性與HMGB1介導的炎癥通路的關系，以期為闡釋甘草炮制雷公藤減毒的作用機制提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物

實驗動物為SPF級SD大鼠，雄性，4～5周齡，體重(200±20)g，共24只(購自華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號：11401300054115)。將大鼠隨機分籠飼養于SPF級實驗室，4只/籠，保證大鼠有充足的活動空間，期間維持室內溫度為25 ℃左右、相對濕度為50±2%，每12 h進行晝夜燈光交替1次。

1.2 儀器

XS205型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；RE-52A型旋轉蒸發儀 (上海亞榮生化儀器廠)；Centrifuge 5424R小型冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)；CKX41型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；BS-300型自動生化儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；SpectraMax?M3酶標儀(美國Molecular Devices公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2型多功能旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)。

1.3 藥材與試劑

雷公藤購自福建省三明市，經首都醫科大學附屬北京友誼醫院中藥劑科趙奎君教授鑒定為衛矛科雷公藤的干燥根莖；生甘草飲片(產地：內蒙古；生產批號：SB7131)購自首都醫科大學附屬北京友誼醫院中藥房。HMGB1(大鼠)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；大鼠白細胞介素(IL)1β、IL-2、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自美國ThermoFisherScientific公司；HMGB1(大鼠)抗體、TLR4(大鼠)抗體均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；NF-κB(大鼠)抗體購自美國CST公司；二抗(山羊抗兔鼠通用)購自以色列Biological Industries生物科技公司；天冬氨酸轉氨酶(AST)試劑盒、丙氨酸轉氨酶(ALT)試劑盒均購南京建成生物工程研究所有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 雷公藤樣品的制備

稱取約2 500 g雷公藤生藥，切碎為大小約2～3 cm的不規則碎塊，取其中1/2(另1/2用于炮制)，按比例稱量8倍體積去離子水，用去離子水浸泡30 min；然后用電磁爐煎煮，輸出功率維持在1 000 W左右，煎煮40 min；然后用0.25 cm藥篩過濾，過濾后再次加入稱量好的8倍體積去離子水，再次煎煮40 min，以相同條件過濾，合并兩次濾液，將合并后的濾液置于旋轉蒸發儀中濃縮，放入4 ℃冰箱，使用時再稀釋。

2.2 甘草炮制雷公藤樣品制備

2.2.1 甘草汁的制備：按雷公藤-甘草飲片質量比3∶1來稱量所需的甘草片，以8倍體積的水提前浸泡甘草飲片30 min，然后煎煮20 min，用0.25 cm藥篩過濾，收集濾液；采用相同方法煎煮3次，用旋轉蒸發儀將合并后的濾液濃縮至合適體積，備用。

2.2.2 甘草制雷公藤樣品的制備：將上述另1/2已經切碎為2～3 cm碎塊的雷公藤生藥稱量，分批放于1 000 mL燒杯里，加入制備好的甘草汁，以3∶1的質量比浸泡雷公藤生藥，常溫(25 ℃)過夜，甘草汁需沒過雷公藤，使雷公藤充分吸收甘草汁。將浸泡過夜充分吸收甘草汁的雷公藤放入鍋內，加熱并維持100 ℃，炒制10 min至雷公藤表面不粘手，得到甘草制雷公藤樣品。使用“2.1”項下方法制成甘草炮制雷公藤的水煎劑，臨用前配制成相應濃度(給藥劑量以雷公藤生藥量計)。

2.3 動物分組與給藥

將24只SD大鼠隨機分為3組，分別為空白對照組、雷公藤組(相當于生藥16 g/kg)和甘草炮制雷公藤組(相當于雷公藤生藥16 g/kg)。給藥組大鼠連續灌胃給藥3周，空白對照組大鼠灌胃相同體積的0.9%氯化鈉溶液。

2.4 動物取材及指標檢測

每隔7 d于大鼠尾靜脈取血，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清中肝臟生化指標AST和ALT水平；末次給藥結束，取血檢測大鼠血清中炎癥因子HMGB1、IL-1β、IL-2和TNF-α水平；末次給藥結束后(第21日)，取大鼠肝臟組織，一部分放入配好的福爾馬林里為蘇木精-伊紅(HE)染色切片備用；另一部分放入液氮中，采用蛋白質印跡法檢測肝臟組織中HMGB1、TLR4和NF-κB的表達。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 血清中ALT、AST含量檢測結果

給藥1周，空白對照組、雷公藤組和甘草炮制雷公藤組大鼠組間ALT、AST含量的差異無統計學意義(P>0.05)。雷公藤組大鼠給藥2周后的血清ALT、AST含量高于空白對照組(P<0.05)，給藥3周后顯著高于空白對照組(P<0.01)；同時雷公藤組大鼠給藥2周后的血清ALT、AST含量高于甘草炮制雷公藤組(P<0.05)，且給藥3周后顯著高于甘草炮制雷公藤組(P<0.01)，上述差異均有統計學意義，見表1。甘草炮制雷公藤組大鼠血清AST含量在給藥3周后高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；ALT含量在不同給藥時間與空白對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組大鼠血清ALT、AST含量的檢測結果比較

3.2 血清中炎癥因子檢測結果

與空白對照組相比，雷公藤組大鼠的血清TNF-α、IL-1β和HMGB1含量均升高(P<0.01)，血清IL-2含量升高(P<0.05)，差異均有統計學意義，見表2。甘草炮制雷公藤組大鼠與空白對照組上述血清炎癥因子含量的差異均無統計學意義(P>0.05)；與雷公藤組相比，甘草炮制雷公藤組大鼠血清TNF-α、IL-1β和HMGB1含量明顯降低(P<0.01)，血清IL-2含量降低(P<0.05)，差異均有統計學意義，見表2。

表2 三組大鼠血清炎癥因子檢測結果比較

3.3 肝組織中HMGB1炎癥通路中關鍵蛋白表達檢測結果

與空白對照組相比，雷公藤組大鼠肝臟中HMGB1、TLR4和NF-κB表達均升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與空白對照組相比，甘草炮制雷公藤組大鼠TLR4、NF-κB表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；甘草炮制雷公藤組大鼠HMGB1表達與空白對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；與雷公藤組相比，甘草炮制雷公藤組大鼠TLR4、NF-κB表達降低(P<0.05)，HMGB1表達顯著降低(P<0.01)，差異均有統計學意義，見表3、圖1。

A.空白對照組；B.雷公藤組；C.甘草制雷公藤組Note: A. blank control group; B. Tripterygium wilfordii group; C. licorice-processed Tripterygium wilfordii group

表3 三組大鼠肝臟組織中HMGB1通路相關蛋白條帶灰度值比值結果比較

3.4 肝組織病理學觀察結果

空白對照組大鼠肝臟組織HE染色均勻，肝臟小葉結構清晰，呈放射狀緊密排列，肝細胞形態良好；雷公藤組大鼠肝臟小葉排列紊亂，肝竇輕度擴張，部分肝細胞胞漿內可見圓形空泡和脂肪變性，局部區域出現點狀炎癥浸潤灶；甘草炮制雷公藤組大鼠肝臟組織HE染色均勻，肝臟小葉結構清晰，呈放射狀排列整齊，肝細胞形態良好，無明顯肝損傷表現，見圖2。

A.空白對照組(×40)；B.空白對照組(×200)；C.空白對照組(×400)；D.雷公藤組(×40)；E.雷公藤組(×200)；F.雷公藤組(×400)；G.甘草炮制雷公藤組(×40)；H.甘草炮制雷公藤組(×200)；I.甘草炮制雷公藤組(×400)A.blank control group(×40)；B.blank control group(×200)；C.blank control group(×400)；D.Tripterygium wilfordii group(×40)；E.Tripterygium wilfordii group(×200)；F.Tripterygium wilfordii group(×400)；G.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×40)；H.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×200)；I.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×400)

4 討論

雷公藤在自身免疫性疾病尤其是類風濕關節炎治療中的效果尤為顯著[17]。研究結果表明，低劑量使用雷公藤紅素具有顯著的減肥效果，應用前景廣泛[18]。但由于雷公藤的活性成分同時也是其毒性成分，導致臨床應用過程中極易出現不良反應，近年來報道的藥物性肝損傷事件中，雷公藤位列單味中藥之首[19]。雷公藤的不良反應限制了其在臨床中的應用和發展，因此，雷公藤的減毒存效研究極為重要。在中醫藥理論指導下，深入研究雷公藤毒性發生的機制，通過不同炮制配伍方法降低毒性，并保持或提高雷公藤的療效，是合理開發應用雷公藤的重要課題。近年來，課題組一直致力于雷公藤的毒性及藥效學的研究。根據中藥藥性理論，甘味藥可以緩和藥性。甘草有“解百草毒”之名，“得中和之性，有調補之功”，被《神農本草經》列為上品[20]?！饵S帝內經》中提出“肝苦急，急食甘以緩之”，雷公藤的肝毒性可佐以甘草緩之，起到養護肝臟之效[21]。因此，利用甘草炮制雷公藤增效減毒符合中醫傳統理論。前期研究中，課題組發揮甘草汁炮制毒性中藥的優勢，結合甘草保肝的現代研究成果，開展甘草汁炮制雷公藤降低肝毒性的研究，建立了甘草汁炮制雷公藤的方法，并證實了甘草炮制降低肝毒性的作用[10-11,16-17,22-23]。

HMGB1是一種重要的促炎因子，其主要受體為TLR和晚期糖基化終端產物受體[12]。研究結果表明，在多種肝損傷疾病中，HMGB1表達水平明顯升高。HMGB1在炎癥反應中被釋放，遷移到胞外，與相應受體特異性結合，通過調節NF-κB入核，激活下游因子的表達，來促進炎癥發生[24-28]。課題組前期已證實雷公藤的肝毒性與其激活HMGB1通路有關，本研究在此基礎上進一步研究了甘草炮制雷公藤降低肝毒性與HMGB1通路的關系，為解釋甘草炮制雷公藤減毒的機制提供依據。當

然，甘草炮制雷公藤減毒還有其他減毒的內在機制，包括化學成分的改變、體內靶點的改變等，需要繼續研究和探索。另外，在關注雷公藤減毒的前提下，也應關注其藥理活性，在合理避毒的情況下，充分發揮雷公藤的強大免疫抑制能力才是最終目的，課題組后期會持續進行相關研究。