大黃免煎顆粒對α-萘異硫氰酸酯誘導的肝內膽汁淤積大鼠氧化應激損傷的修復及核因子κB通路的調節作用研究Δ

張 英，侯偉娜，孫 琦，張 瑩，李曉景，任曉華，謝克讓，安翠平

(1.石家莊市第一醫院藥劑科，石家莊 050011； 2.石家莊市第一醫院輸血科，石家莊 050011)

肝內膽汁淤積是由于機體內膽紅素代謝障礙引起的一種病理生理過程，是引起肝功能損傷的一種常見致病因素[1]。核因子κB(NF-κB)信號通路是參與炎癥信號轉導的重要信號通路，研究結果發現，肝內膽汁淤積的疾病進展及預后與NF-κB信號通路的調節異常密切相關[2-3]。大黃來源于掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、藥用大黃(RheumoffcinaleBaill.)和唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex Balf.)的干燥根和根莖，具有抗炎、抗腫瘤和調節胃腸功能紊亂等藥理作用[4]。大黃對肝內膽汁淤積具有顯著療效[5-6]。大黃免煎顆粒是由大黃飲片制成的新制劑，具有與大黃飲片等效的藥理活性及作用[7]。本研究探討了大黃免煎顆粒對α-萘異硫氰酸酯(ANIT)誘導的肝內膽汁淤積大鼠氧化應激損傷的修復及NF-κB通路的調節作用，旨在為大黃免煎顆粒的藥理作用研究及其對肝內膽汁淤積的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級SD大鼠60只，雄性，6～8周齡，體重180～220 g，購自河北省實驗動物中心[實驗動物生產許可證號：SCXK(冀)2018-004]，飼養于動物房，溫度20～24 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 儀器

ERM3000型石蠟切片機(常州市郝思琳醫用儀器有限公司)；FLUOstar OPTIMA型多功能酶標儀(香港伯齊科技有限公司)；CKX41-F32FL型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Allegra X-30型臺式離心機[貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]；E-Gel Imager型凝膠成像儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.3 藥品與試劑

大黃免煎顆粒(每2.5 g相當于原藥材6 g，廣東一方制藥有限公司，批號為091108)；ANIT(西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司，批號為140018)；熊去氧膽酸(德國Losan Pharma GmbH公司，規格為250 mg，批號為180915)；NF-κB p65(貨號：AF0246)及p-NF-κB p65(貨號：AF5875)兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG，貨號：A0208)和GAPDH兔單克隆抗體(貨號：AF1186)，均購自碧云天生物科技有限公司；伊紅染液(貨號：Y13 M6C2)、蘇木精染液(貨號：J28N6Y6648)，均購自源葉生物科技有限公司；超敏ECL化學發光試劑盒(貨號：PE0010)、RIPA蛋白裂解液(貨號：R0010)，均購自北京索萊寶科技有限公司；SOD活性(WST-8法)檢測試劑盒(貨號：ab65354)、MDA檢測試劑盒(貨號：ab118970)，均購自艾博抗貿易有限公司。

1.4 肝內膽汁淤積大鼠模型的建立

將ANIT 1 g溶于色拉油50 mL中，制成質量分數為2%的ANIT。除15只大鼠作為對照組外，其余45只大鼠參照文獻[8]的方法灌胃給予2% ANIT 100 mg/kg，建立肝內膽汁淤積大鼠模型，以大鼠血清堿性磷酸酶(ALP)、谷酰轉肽酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)和直接膽紅素(DBIL)水平較對照組顯著升高(P<0.05)作為造模成功標志。對照組大鼠給予色拉油。造模完成后分為模型組、大黃免煎顆粒組及陽性對照組，大黃免煎顆粒組大鼠按照4 g/kg的劑量灌胃給予大黃免煎顆粒[9]，陽性對照組大鼠灌胃給予熊去氧膽酸(100 mg/kg)[10]，對照組及模型組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液，均1日1次，連續28 d[11]。

1.5 大鼠血清指標水平的測定

每組取15只大鼠，眼眶取血后，于4 ℃冰箱靜置4 h，4 ℃條件下，3 500 r/min離心(離心半徑15 cm)10 min，取上清液，使用全自動生化分析儀測定丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平。

1.6 大鼠肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平的測定

每組取6只大鼠，頸椎脫臼法處死后分離肝組織，用4 ℃預冷的0.9%氯化鈉溶液對肝組織灌流清洗后，置于組織勻漿器中，加入蒸餾水研磨勻漿，4 ℃條件下，8 000 r/min離心(離心半徑15 cm)10 min，取上清液，使用酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測SOD活性及MDA、GSH水平。

1.7 大鼠肝組織病理學檢查

取大鼠肝組織，使用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，進行4 μm切片，依次經過脫水、透明處理后，常規蘇木精-伊紅染色(HE染色)，在顯微鏡下觀察。

1.8 蛋白質印跡法檢測大鼠肝組織NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白水平

每組取6只大鼠，頸椎脫臼法處死后取肝組織，勻漿器充分裂解勻漿，4 ℃條件下，12 000 r/min離心(離心半徑15 cm)10 min，取上清液，使用BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度；取50 μg蛋白的肝組織勻漿液，上樣至聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離，并轉移至聚偏氟乙烯膜上，封閉液室溫(25 ℃)封閉1 h，經NF-κB p65、p-NF-κB p65兔多克隆抗體及GAPDH兔單克隆抗體(1∶1 000稀釋)在4 ℃條件下孵育過夜，使用含吐溫的磷酸鹽緩沖液清洗3次，1次5 min，室溫下，使用山羊抗兔IgG抗體(1∶2 000稀釋)孵育1 h，清洗3次，在凝膠成像儀拍照，應用Image J 1.8.0軟件進行定量分析。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 四組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平比較

與對照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平顯著升高；與模型組比較，大黃免煎顆粒組、陽性對照組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與大黃免煎顆粒組比較，陽性對照組大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，GGT水平的差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 四組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平比較

2.2 四組大鼠肝組織SOD活性、MDA及GSH水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肝組織MDA、GSH水平顯著升高，SOD活性顯著降低；與模型組比較，大黃免煎顆粒組、陽性對照組大鼠肝組織MDA、GSH水平顯著降低，SOD活性顯著升高，上述差異均有統計學意義(P<0.05)；與大黃免煎顆粒組比較，陽性對照組大鼠肝組織SOD活性降低，差異有統計學意義(P<0.05)，MDA、GSH水平的差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 四組大鼠肝組織SOD活性、MDA及GSH水平比較

2.3 四組大鼠肝組織病理學檢查

對照組大鼠肝組織無明顯病理改變，結構正常；與對照組比較，模型組大鼠匯管區膽管增生明顯，上皮細胞壞死脫落，大量炎癥細胞浸潤，肝組織損傷嚴重，中心靜脈充血明顯，中心靜脈區周圍細胞壞死，有炎癥細胞滲入；與模型組比較，大黃免煎顆粒組、陽性對照組大鼠肝組織病理學明顯恢復，膽管擴張及增生減輕，炎癥細胞浸潤減少，上皮細胞脫落及壞死減輕，肝組織細胞炎癥浸潤減少；與大黃免煎顆粒組比較，陽性對照組大鼠肝組織膽管擴張減輕，炎癥浸潤略減少，見圖1。

A.對照組；B.模型組；C.大黃免煎顆粒組；D.陽性對照組A. control group; B. model group; C. Dahuang granule prescription group; D. positive control group

2.4 四組大鼠肝組織NF-κB p65、p-NF-κB p65水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肝組織NF-κB p65、p-NF-κB p65水平顯著升高；與模型組比較，大黃免煎顆粒組、陽性對照組大鼠肝組織NF-κB p65、p-NF-κB p65水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與大黃免煎顆粒組比較，陽性對照組大鼠肝組織NF-κB p65、p-NF-κB p65水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05;與大黃免煎顆粒組比較，△P<0.05Note: vs. the control group, *P<0.05; vs. the model group, #P<0.05; vs. the Dahuang granule prescription group, △P<0.05

3 討論

肝內膽汁淤積是由于膽汁分泌及排泄障礙引起的肝臟及體循環膽紅素等膽汁成分的過度堆積，進而引起的肝細胞損傷及肝功能障礙，長期持續的膽汁淤積會誘導肝組織發生纖維化甚至進展為肝硬化等嚴重疾病，目前臨床上常使用熊去氧膽酸等利膽藥進行治療，故本研究使用熊去氧膽酸作為陽性對照藥[12]。ANTI誘導的肝內膽汁淤積是目前實驗中建立肝內膽汁淤積動物模型的一種常用方法。

大黃為常用的中藥材，中醫學認為大黃具有瀉熱通腸、涼血解毒和逐瘀通經等作用。現代醫學研究結果發現，大黃能促進肝內膽汁淤積大鼠膽汁的排泄，修復肝損傷[13]；陳鵬等[5]指出，大黃可以緩解肝內膽汁淤積所致大鼠肝損傷，且效果優于地塞米松及熊去氧膽酸；劉萍等[6]的研究結果表明，大黃能夠通過促進大鼠胃腸消化間期移行性復合肌電活動，進而促進膽汁淤積大鼠的膽汁排泄。免煎顆粒是由中藥材飲片經過加工、提取等工藝制得的新型制劑，已有研究結果證實其與傳統藥材飲片藥效學等同，且具有方便、安全的優勢，在臨床應用中受到廣泛認可[14]。

ALT、AST、ALP和GGT是臨床常用的反映肝功能的直接指標，其水平升高提示肝功能降低及肝細胞損傷[15]；TBIL、DBIL是體現體內膽紅素水平及代謝的指標，其水平升高提示體內膽汁排泄障礙[16]；SOD、MDA及GSH是機體氧化應激及自我修復的常用指標，SOD活性降低、MDA和GSH水平升高均提示體內存在一定程度的氧化應激損傷[17]。本研究結果表明，大黃免煎顆粒組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和DBIL水平降低，肝組織MDA、GSH水平降低，肝組織SOD活性升高，提示大黃免煎顆粒能夠改善并修復大鼠肝細胞的損傷，促進膽汁代謝及排泄，緩解肝組織細胞氧化應激損傷。與陽性對照藥熊去氧膽酸比較，大黃免煎顆粒組大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL水平升高，但仍在正常值范圍內，且GGT水平與陽性對照組相當，提示大黃免煎顆粒具有顯著的肝功能恢復作用；同時，與熊去氧膽酸組比較，大黃免煎顆粒能夠顯著提高大鼠肝組織SOD活性，提示大黃免煎顆粒較熊去氧膽酸能夠更顯著修復肝細胞氧化損傷。

NF-κB信號通路是肝臟氧化應激損傷及炎癥信號傳導的關鍵通路之一。近年來的研究結果發現，肝內膽汁淤積引起的肝細胞損傷與NF-κB信號通路改變相關，抑制NF-κB相關蛋白的過表達，能夠減輕肝內膽汁淤積大鼠肝臟炎癥損傷，并能夠修復大鼠胃腸道黏膜[18-19]。本研究結果表明，大黃免煎顆粒組大鼠肝組織NF-κB p65及p-NF-κB p65水平降低，組織病理學顯著改善，提示大黃免煎顆粒能夠通過調節肝組織細胞NF-κB信號通路，促進肝臟組織病理學的恢復，改善肝內膽汁淤積大鼠疾病轉歸及預后。同時，與陽性對照藥熊去氧膽酸組比較，大黃免煎顆粒組大鼠肝組織NF-κB p65、p-NF-κB p65水平降低更明顯，提示大黃免煎顆粒較熊去氧膽酸具有更顯著的NF-κB信號通路及蛋白抑制作用，這也提示了大黃免煎顆粒與熊去氧膽酸在作用機制上存在一定的差異。本研究證實了大黃免煎顆粒對于肝內膽汁淤積大鼠具有顯著的肝功能修復作用，并能夠呈劑量依賴性地顯著抑制NF-κB信號通路及蛋白的磷酸化水平，進而抑制大鼠肝組織氧化應激損傷，修復肝組織細胞功能及病理學改變，為大黃免煎顆粒在肝內膽汁淤積治療中的應用提供新的參考，并為大黃免煎顆粒的臨床開發提供新的證據。

綜上所述，大黃免煎顆粒能夠明顯修復大鼠肝功能及肝組織氧化應激損傷，改善膽汁代謝水平，其機制可能與調節NF-κB通路有關。