基于miR-181/NF-κB通路的辛伐他汀對結直腸癌小鼠血液高凝狀態的改善研究Δ

張 蕊，常 娜，陳 超，趙 萌，李 博

(1.唐山市人民醫院藥劑科，河北 唐山 063000； 2.唐山市人民醫院放化五科，唐山市腫瘤放射治療學重點實驗室，河北 唐山 063000； 3.遵化市人民醫院病理科，河北 遵化064299)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)為常見的消化道腫瘤，手術、化療和放療是治療CRC的主要方法，但是臨床發現CRC患者機體可能處于高凝狀態，并且手術和化療均可能誘導高凝狀態，這不但會影響預后，還會增加肺栓塞的發生風險[1]。辛伐他汀能夠通過抑制3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)而降低膽固醇，被廣泛用于治療高膽固醇血癥，且安全性良好。近年來，有研究報道HMGCR與腫瘤細胞增殖密切相關[2]。細胞和體內實驗結果顯示，辛伐他汀可以抑制CRC細胞的增殖和血管生成能力[3]。但其分子機制仍不清楚。此外，有研究結果發現，辛伐他汀具有緩解高凝狀態的作用[4]。但其是否具有緩解CRC高凝狀態的作用仍不明確。核因子κB(NF-κB)信號轉導通路的激活均會誘導其靶基因的過表達，進而促進血管生成，促進結直腸癌細胞的增殖、侵襲和轉移；同時，NF-κB通路與機體凝血過程和高凝狀態密切相關[5-6]。微小RNA(miRNA)可以通過靶向信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(UTR)誘導mRNA降解，研究結果已證實miR-181在CRC中具有促進腫瘤進展的作用[7]；并且，miR-181也可以靶向抑制NF-κB通路[8]。本研究主要探討辛伐他汀對CRC模型小鼠腫瘤生長、血液高凝狀態和血管生成情況的影響，并檢測miR-181/NF-κB的變化，初步分析分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞：BALB/C裸鼠購自中國上海斯萊克實驗動物中心；人CRC細胞系SW480(CCL-228細胞，美國ATCC公司)。

1.1.2 儀器：MVIS-2035型全自動血液流變分析儀(重慶天海醫療設備有限公司)；ABI7900型PCR儀(美國ABI公司)；CX31型顯微鏡[奧林巴斯(中國)有限公司]。

1.1.3 藥品與試劑：DMEM培養基購自美國Invitrogen公司；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；ECL顯色試劑盒購自美國賽默飛世爾公司；酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TRIzol試劑盒購自美國Sigma公司；MiScript SYBR-Green PCR和miScript kit試劑盒購自德國QIAGEN GmbH公司；SYBR Premix Ex Taq和PrimeScript-RT試劑盒購自日本Takara公司；細胞周期蛋白 D1(CyclinD1)、Ki67和B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體和相應的二抗購自美國Abcam公司；辛伐他汀(江西大地制藥有限責任公司，批準文號：國藥準字H20059672)。

1.2 分組和建模

將BALB/C裸鼠分為三組，即對照組、辛伐他汀低劑量組和辛伐他汀高劑量組。將DMEM培養基中處于對數生長期的SW480細胞重新配置成濃度為1×107個/mL的溶液，所有小鼠于左側前肢皮下注射細胞溶液0.2 mL，給藥后第7日可以觸摸到有瘤體生成提示建模成功。第8日，辛伐他汀低、高劑量組小鼠分別腹腔注射辛伐他汀50、100 mg/kg，1日1次。第28日，小鼠稱重后記錄體重，然后于小鼠眼眶靜脈取血，頸椎脫臼處死小鼠，取出腫瘤組織。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 腫瘤生長情況：觀察并記錄腫瘤生長情況，第28日統計腫瘤體積。用游標卡尺測量瘤體長徑和短徑，腫瘤體積= [(長徑×短徑)/2]3×0.523 6。建模后28 d處死小鼠，收集腫瘤組織稱取重量。

1.3.2 蛋白質印跡法檢測蛋白水平：腫瘤組織研磨后收集總蛋白并通過BCA試劑盒檢測濃度。應用SDS-PAGE(110 V，100 min)分離30 μg的總蛋白。PVDF膜轉移，添加對應的抗體(1∶500稀釋)，孵育過夜。室溫(25 ℃)下加入HRP標記的二抗(1∶5 000稀釋)，4 ℃孵育2 h。采用ECL檢測蛋白印跡帶。GAPDH作為內參。通過檢測灰度分析CyclinD1、Ki67、Bcl-2和Bax蛋白相對表達水平。CyclinD1、Ki67表達水平反映腫瘤細胞增殖水平，Bcl-2、Bax表達水平反映腫瘤細胞凋亡水平。

1.3.3 免疫組織化學染色：采用免疫組化染色檢測血管標志蛋白CD34，分析腫瘤組織中的微血管密度[9]。腫瘤組織固定脫水，石蠟包埋，切片(4 μm)。加入3%H2O2，室溫靜置20 min，加入CD34抗體(1∶400稀釋)，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入山羊抗兔IgG聚合物100 μL于室溫下孵育50 min；洗滌后加入DAB顯色液，蘇木精染色孵育20 s，沖洗后顯微鏡觀察，檢測染色部位面積占總視野面積的比例，計算百分比為微血管密度。檢測血管內皮生長因子(VEGF)的方法同CD34，通過半定量法確定染色強度，根據染色深淺評分為0～3分，根據染色范圍評分為0～4分，兩者相乘得到最終免疫組化得分。

1.3.4 定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-181、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和NF-κB mRNA表達：通過TRIzol試劑盒提取腫瘤組織總RNA，利用miScript試劑盒將miR-181合成互補DNA，采用MiScript SYBR-Green PCR試劑盒進行qPCR實驗，內參為U6。采用SYBR Premix Ex TaqTM和PrimeScript-RT試劑盒進行反轉錄(反應條件：60 min/42 ℃，5 min/70 ℃，4 ℃下保存)和qPCR(反應條件：95 ℃/10 min，40個循環，94 ℃/15 s，60 ℃/1 min，60 ℃/1 min，4 ℃下保存)實驗，內參為GAPDH。通過比較循環閾值(ΔΔCt)分析RNA的表達水平。

1.3.5 CRC模型小鼠凝血功能檢測：留取小鼠血液樣本，采用全自動動物血液分析儀檢測活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)和全血黏度。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 辛伐他汀對CRC模型小鼠腫瘤的影響

建模后第28日，辛伐他汀高劑量組小鼠的腫瘤體積和重量明顯低于辛伐他汀低劑量組，且辛伐他汀高、低劑量組小鼠的腫瘤體積和重量明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 辛伐他汀對CRC裸鼠腫瘤體積和重量的影響

2.2 辛伐他汀對CRC裸鼠模型細胞增殖的影響

辛伐他汀高劑量組小鼠Ki67、CyclinD1蛋白水平明顯低于辛伐他汀低劑量組，且辛伐他汀高、低劑量組小鼠Ki67、CyclinD1蛋白水平明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表2。

表2 辛伐他汀對CRC裸鼠CyclinD1和Ki67蛋白的影響

A.對照組；B.辛伐他汀低劑量組；C.辛伐他汀高劑量組A. control grou; B. simvastatin low-dose group; C. simvastatin high-dose group

2.3 辛伐他汀對CRC模型裸鼠細胞凋亡蛋白表達的影響

抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax檢測結果表明，辛伐他汀高劑量組小鼠腫瘤組織中Bax表達水平明顯高于辛伐他汀低劑量組，而Bcl-2表達水平明顯低于辛伐他汀低劑量組；且辛伐他汀高、低劑量組小鼠腫瘤組織中Bax表達水平明顯高于對照組，而Bcl-2表達水平明顯低于對照組，上述差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2、表3。

A.對照組；B.辛伐他汀低劑量組；C.辛伐他汀高劑量組A.control grou; B.simvastatin low-dose group; C.simvastatin high-dose group

表3 辛伐他汀對CRC裸鼠Bcl-2和Bax蛋白的影響

2.4 辛伐他汀對CRC裸鼠模型微血管密度的影響

辛伐他汀高劑量組小鼠微血管密度明顯低于辛伐他汀低劑量組，且辛伐他汀高、低劑量組小鼠微血管密度均低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3、表4。圖3中，藍色為細胞核，棕色為CD34陽性染色，表示微血管。

A.對照組；B.辛伐他汀低劑量組；C.辛伐他汀高劑量組A.control grou; B.simvastatin low-dose group; C.simvastatin high-dose group

表4 辛伐他汀對CRC裸鼠微血管密度的影響

2.5 辛伐他汀對CRC裸鼠模型VEGF的影響

辛伐他汀高劑量組小鼠VEGF水平明顯低于辛伐他汀低劑量組，且辛伐他汀高、低劑量組小鼠VEGF水平均低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4、表5。圖4中，藍色為細胞核，棕色為VEGF陽性顏色。

A.對照組；B.辛伐他汀低劑量組；C.辛伐他汀高劑量組A. control grou; B. simvastatin low-dose group; C. simvastatin high-dose group

表5 辛伐他汀對CRC裸鼠VEGF水平的影響分)

2.6 辛伐他汀對CRC裸鼠模型血液流變學指標的影響

三組小鼠血液流變學指標比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，辛伐他汀低、高劑量組小鼠的全血黏度降低，PT和APTT延長，差異均有統計學意義(P<0.05)；且辛伐他汀高劑量組小鼠的全血黏度低于辛伐他汀低劑量組，PT和APTT長于辛伐他汀低劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 辛伐他汀對CRC裸鼠血液流變學指標的影響

2.7 辛伐他汀對CRC裸鼠模型miR-181、IκBα和NF-κB mRNA和蛋白表達的影響

三組小鼠miR-181、IκBα和NF-κB mRNA表述水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。辛伐他汀低、高劑量組小鼠的miR-181表達水平顯著高于對照組，IκBα和NF-κB mRNA表達水平顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；

且辛伐他汀高劑量組小鼠的miR-181表達水平顯著高于辛伐他汀低劑量組，IκBα和NF-κB mRNA表達水平顯著低于辛伐他汀低劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表7。三組小鼠IκBα和NF-κB蛋白表述水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。辛伐他汀高劑量組小鼠NF-κB、IκBα蛋白表達水平低于低劑量組，辛伐他汀低、高劑量組小鼠的IκBα和NF-κB 蛋白表達水平低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖5、表8。

表7 辛伐他汀對CRC裸鼠IκBα、NF-κB mRNA表達的影響

表8 辛伐他汀對CRC裸鼠IκBα、NF-κB蛋白表達的影響

A.對照組；B.辛伐他汀低劑量組；C.辛伐他汀高劑量組A.control grou; B.simvastatin low-dose group; C.simvastatin high-dose group

3 討論

一項全球性的統計結果顯示，2018年結腸和直腸原發性腫瘤患者分別為1 096 601例和704 376例，分別占所有腫瘤患者的6.1%和3.9%，分別居第4位和第8位；每年死于結腸癌和直腸癌的患者分別占所有腫瘤患者的5.8%和3.2%，分別居第5位和第10位[10]。雖然新的診斷和治療CRC的方法被不斷應用于臨床，但是CRC患者的生存情況仍不能令人滿意。在臨床上，CRC轉移是導致治療失敗的主要因素，會使生存率降低。此外，CRC患者的高凝狀態也會顯著影響手術預后[11]。但目前臨床上尚無可以有效抑制CRC和緩解高凝狀態的特效藥物。

有研究結果顯示，他汀類藥物具有抗腫瘤作用，與未使用他汀類藥物者相比，使用他汀類藥物者的全因死亡率和惡性腫瘤特異性死亡率降低了15%[12]。臨床前研究結果表明，辛伐他汀在抑制腫瘤增殖、誘導細胞凋亡和抑制腫瘤轉移中起著重要的作用[13-14]。本研究通過皮下注射的方法構建了CRC小鼠模型，并通過辛伐他汀干預，發現辛伐他汀能夠抑制細胞增殖，減少血管生成，抑制腫瘤組織生長，促進腫瘤細胞凋亡，并存在一定的劑量依賴性。HMGCR為內質網駐留酶，研究結果顯示，其可以促進腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的轉移[15]。作為HMGCR抑制劑，辛伐他汀在CRC中也發揮抑癌作用。一項單臂Ⅱ期臨床研究結果顯示，在XELOX方案(卡培他濱+奧沙利鉑)和貝伐單抗的基礎上聯合辛伐他汀作為CRC患者一線化療方法，具有優秀的抗腫瘤效果[16]。血管生成是CRC細胞轉移的關鍵，腫瘤細胞會通過新生的血管系統進入血液循環，并定植于肺部等部位[17]。Wang等[18]的研究結果顯示，辛伐他汀可激活AMP活化蛋白激酶通路和抑制缺氧誘導因子-1α的水平，抑制乳腺癌的血管生成。此外，辛伐他汀還具有抗凝作用。趙濤等[19]的研究結果顯示，辛伐他汀可以降低急性心肌梗死患者的全血黏度，延長PT。有研究結果顯示，口服辛伐他汀會明顯降低接受結直腸手術患者的高凝狀態[20]。本研究結果發現，辛伐他汀可以劑量依賴性地抑制CRC細胞的增殖和血管生成，并誘導細胞凋亡，從而抑制小鼠模型的腫瘤生長，并且可以劑量依賴性地緩解CRC模型小鼠的高凝狀態，但其分子機制仍需進一步分析。

基因表達的轉錄調控機制是近年來的研究熱點，miRNA可通過堿基配對識別并結合mRNA，進而誘導mRNA的降解或者抑制翻譯[21]。miR-181是近年來新發現的與惡性腫瘤發生發展密切相關的miRNA，研究結果顯示，其具有抑制結直腸腫瘤進展的作用[22]。體外研究結果也證實，miR-181會抑制CRC細胞的增殖[23]。miR-181具有靶向調控NF-κB通路的作用，如卵巢癌中，miR-181通過抑制NF-κB通路蛋白水平發揮抗腫瘤作用[24]。Zhu等[25]的研究結果顯示，miR-181通過抑制NF-κB通路調控炎癥反應。研究結果顯示，在2型糖尿病患者中，血漿miR-181與凝血狀態呈負相關，miR-181會調控D-二聚體的水平并緩解高凝狀態和減少血栓形成[26]。NF-κB信號通路參與脂多糖誘導的細胞凝血和纖溶因子表達異常，從而導致高凝狀態[27]。王慧蓮等[28]的研究結果顯示，NF-κB會通過促進炎癥反應，引起類風濕關節炎患者血液高凝狀態，而miR-155通過靶向調控NF-κB通路緩解高凝狀態。本研究結果顯示，辛伐他汀可以促進miR-181表述，抑制NF-κB通路中IκBα、NF-κB mRNA和蛋白的水平，且呈劑量依賴性。提示辛伐他汀可能通過誘導miR-181的表達和抑制NF-κB通路來抑制CRC小鼠模型的腫瘤生長和血管生成，并緩解高凝狀態。

綜上所述，在CRC裸鼠模型中，辛伐他汀不但可以誘導CRC細胞的凋亡和抑制血管生成，還可以緩解高凝狀態，其作用可能與miR-181/NF-κB有關。但是，關于辛伐他汀在CRC中的作用和調控miR-181/NF-κB的分子機制仍需要進一步研究。