基于Levey-Jennings質控圖聯合Westgard多規則理論建立萬古霉素治療藥物監測的室內質控評估方法

李會婷，吳 妍，張哲弢，史天陸

(中國科學技術大學附屬第一醫院/安徽省立醫院藥劑科，合肥 230001)

萬古霉素為糖肽類抗菌藥物，用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、腸球菌及耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌等革蘭陽性菌感染。美國感染病學會發布的有關MRSA感染治療指南[1]和《萬古霉素臨床應用中國專家共識(2011版)》[2]指出，萬古霉素治療金黃色葡萄球菌感染成敗與其血藥谷濃度高低有關，同時不良反應(尤其是腎毒性)的發生與其血藥濃度過高有關。2020年美國萬古霉素治療嚴重MRSA感染的治療藥物監測指南[3]和《中國萬古霉素治療藥物監測指南(2020更新版)》[4]推薦，對于重癥監護病房患者、肥胖患者、燒傷患者、應用腎損害藥物患者及腎功能不全患者、新生兒/兒童患者、接受腎臟替代治療等患者，應進行萬古霉素監測。目前，萬古霉素的治療藥物監測方法包括熒光偏振免疫分析法、微生物法等[5]。但高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)仍是使用最普遍的方法[6-7]。其較為經濟，但步驟繁瑣，結果影響因素較多，而國內沒有配備定值質控品，對于萬古霉素室內質控研究較少且不夠完整。因此，本研究在已有實驗室條件下，對 HPLC法測定萬古霉素血藥濃度的室內質量控制評價體系進行了相關探索。

1 材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-2010A型高效液相色譜儀(紫外檢測器，LabSolutions Version 5.51 色譜工作站，日本島津公司)；MS205DU型十萬分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；SB-5200D型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TGL-16B型高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 藥品與試劑

萬古霉素對照品(批號：130360-201302)，去甲萬古霉素(批號：130338-201704，含量87.7%)，均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇(HPLC級，西隴科學股份有限公司)；水為超純水；健康人空白血清由我院輸血科提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：磷酸二氫鉀-甲醇(V∶V=87∶ 13)；檢測波長：230 nm；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 萬古霉素工作液的配制

精密稱取萬古霉素適量至5 mL容量瓶中，以超純水稀釋至刻度得到1 mg/mL萬古霉素儲備液。取適量注射用水，依次將儲備液稀釋為25、50、100、250和500 μg/mL系列濃度的萬古霉素工作液，于4 ℃冰箱備用。

2.3 去甲萬古霉素工作液的配制

精密稱取去甲萬古霉素5 mg至25 mL容量瓶中，以注射用水稀釋至刻度，溶解后得到200 μg/mL去甲萬古霉素內標溶液。

2.4 自制血漿質控品的制備

參考文獻[8]，取健康人血清90 μL，分別加入25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL和1 mg/mL萬古霉素工作液10 μL，得到新鮮配制的自制質控品，質量濃度分別為2.5、5、10、25、50和100 μg/mL。

2.5 方法學驗證

2.5.1 專屬性考察：按照“2.1”項下色譜條件下進樣，去甲萬古霉素、萬古霉素保留時間分別12.793 、17.707 min，與血清內其他成分分離良好，空白血清無干擾，見圖1。

A.空白血清樣品；B.血清+內標+萬古霉素；1.去甲萬古霉素內標；2.萬古霉素A.blank serum; B.serum+internal standard+vancomycin; 1.norvancomycin; 2.vancomycin

2.5.2 標準曲線及最低定量限的建立：取“2.4”項下各質量濃度的自制血漿質控品，分別加入去甲萬古霉素20 μL，混勻30 s后加入10%高氯酸溶液100 μL，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min(離心半徑6 cm)，取上清液80 μL，按照“2.1”項下色譜條件進樣并測定。以萬古霉素濃度(X，μg/mL)為橫坐標，以萬古霉素峰面積與內標峰面積比值(Y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，Y=0.059 4X-0.082 4，r=0.999 8，結果表明，萬古霉素血清質量濃度在2.5～100 μg/mL線性良好，血清中最低定量限為0.5 μg/mL。

2.5.3 精密度及回收率測定：取新鮮配制的高、中、低濃度質控品(質量濃度分別為50、25、10 μg/mL)，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析。每個濃度平行操作6次，計算日內精密度；連續測定3 d，計算日間精密度。同時，取新鮮配制的高、中、低濃度質控品，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，萬古霉素色譜峰面積與內標色譜峰面積比值代入相對應的隨行標準曲線中，每個濃度平行操作6次，計算日內回收率；連續測定3 d，計算日間回收率。結果均滿足《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)[9]中生物樣品檢測的要求，見表1。

表1 萬古霉素血藥濃度監測室內質控精密度和回收率結果(n=6)

2.5.5 繪制Z-分數質控圖：由于選擇了3個質控濃度，為了多水平、更直觀準確地進行質量控制，在Levey-Jennings質控圖基礎上，將低、中、高濃度質控樣品轉換成Z-分數形式，繪制在單張質控圖進行比較。轉換公式為，Z=(x-xmat)/s，x為質控品測定值，xmat為同一水平質控品測定值的平均值，s為該質控品的標準差[10]。運用Excel軟件繪制Z分數圖(見圖2)，結合Westgard 12 s/13 s/22 s/R4 s/41 s/10x多規則質控原則，當出現1次2<|Z|<3時，違反12 s規則，提出警告1次，當出現1次|Z|>3時，違反13 s規則，提出失控1次；當連續2次出現2<|Z|<3時，違反22 s規則，或連續2次Z之間差值>4，違反R4 s規則，提示失控；連續4次|Z|>1，違反41 s規則，或連續10次|Z|>0，違反10x規則，均提示失控。結果顯示，高濃度質控品第22次、第23次2次Z差值為4.08，違反R4 s規則，提示失控1次，經分析考慮為隨機誤差所致。查找原因發現為操作人員不同所致，后調整操作人員重新操作測定后未有誤差出現。

A.高濃度質控品Levey-Jennings質控圖；B.中濃度質控品Levey-Jennings質控圖；C.低濃度質控品Levey-Jennings質控圖；D.高、中、低濃度質控品Z-分數質控圖A. Levey-Jennings chart of high concentration quality control samples; B. Levey-Jennings chart of medium concentration quality control samples; C. Levey-Jennings chart of low concentration quality control samples; D. Z-score charts of high, medium and low concentration quality control samples

2.6 萬古霉素血藥濃度監測數據

2020年6—8月測定萬古霉素39例次，共29例患者，其中6例患者測定2次，1例患者測定5次。首次總體監測結果顯示，僅41.38%的萬古霉素血藥谷濃度在正常范圍內，低于正常范圍的有9例，高于正常范圍的有8例；萬古霉素血藥谷濃度監測≥2次的7例患者中，4例經劑量調整后，萬古霉素血藥谷濃度恢復至正常范圍；萬古霉素治療期間，共2例患者發生腎損傷，其萬古霉素質量濃度均>20 μg/mL，見表2。

表2 萬古霉素血藥谷濃度總體監測和首次監測濃度分布及腎損傷發生情況

3 討論

萬古霉素是治療MRSA感染的主要藥物之一，但其治療指數窄，個體差異較大[11-12]。若血藥濃度過低，達不到治療效果，易產生耐藥；血藥濃度過高，則易引起不良反應(如腎毒性、耳毒性等)，因此，根據萬古霉素血藥濃度監測結果進行個體化用藥方案的調整，保證患者達到安全、有效的治療效果尤為重要[13-14]。而治療藥物監測結果的準確性是臨床制定和調整個體化給藥方案的重要影響因素之一，質控方法的建立在一定程度上可以保證樣品測定的準確性及穩定性，因此，建立一套完整的質控體系以保證監測結果的準確性是非常重要的。

自制萬古霉素質控血清制備方法簡單、成本低廉，其可行性已有文獻報道[8]。繪制Levey-Jennings質控圖是實驗室常用于判斷質控樣本合格與否的方法，其通過上下警戒線、失控線來對質控結果進行簡單判定，但只對隨機誤差敏感，且只能顯示單個濃度測定的精密度。而Z-分數質控圖可用于多水平的質控物，全面反映多個濃度的質控結果[15]。Westgard多規則質控規則中的13 s規則和R4 s規則可及時發現隨機誤差，22 s規則、41 s規則和10x規則可及時發現系統誤差，Westgard多規則質控規則與Levey-Jennings質控圖和Z分數質控圖聯合，不僅可以更為準確地判定測定結果的準確性，還可以在發生失控時，確定失控類型，為失控原因的確定提供幫助[16-18]。

通過本實驗室連續性質控評價發現，本批次自制萬古霉素質控血清共發生警告4次，失控1次，失控發生于高濃度質控品，第22次、第23次2次Z差值為4.08，違反R4 s規則。當發生失控時，及時查明原因，排除誤差，分析可能存在的影響因素并及時糾正，以保證血藥濃度檢測結果的準確性是十分必要的。因此，實驗中應詳細記錄試劑批號、操作人員、定標日期、實驗室環境、冰箱溫度、測定中的異常現象、儀器的校正及故障等信息，以便及時發現造成誤差的原因。根據我院實驗室情況，分析產生隨機誤差的原因主要為環境溫度改變、操作人員不同等；產生系統誤差的原因主要為試劑的“瓶底效應”、移液槍的校正等[19-20]。

目前，國內外指南推薦成人萬古霉素有效谷濃度為10～20 μg/mL，新生兒/兒童患者萬古霉素谷濃度維持在5～15 mg/L[21]。指導劑量調整最關鍵和實用的為萬古霉素血藥谷濃度[22]。按照常規劑量(15 mg/L，每12 h給藥1次)給藥時，其導致腎功能損害的發生率為1%～5%[2,23]。本研究初步統計了2020年6—8月29例患者萬古霉素血藥濃度測定結果，結果顯示，僅有41.38%的患者萬古霉素血藥濃度在正常范圍內，與文獻中的達標率基本一致[24]。多次進行萬古霉素血藥谷濃度監測的7例患者中，4例通過調整用藥方案再次監測血藥濃度恢復至正常范圍，腎損傷發生率為6.90%，略高于文獻報道[2，23]。分析原因，首先，本研究分析例數偏少；其次，我院萬古霉素監測人群均為老年人及危重癥患者，該人群臟器功能差，聯合用藥較多，發生腎損傷患者的萬古霉素血藥濃度均>20 μg/mL，可知腎毒性的發生與血藥濃度過高有著密切聯系[25-26]。

本研究較為全面地建立了HPLC法測定萬古霉素血藥濃度的質控評價方法，應用Levey-Jennings質控圖聯合Westgard多規則理論進行質控評估，能夠提高誤差的檢測靈敏度并提示誤差的性質，以便發現各種測定誤差并及時糾正，保證血藥濃度測定的準確性，為臨床制定合理的個體化給藥方案提供準確參考。