響應面優化石榴汁酶解工藝

潘紅軍，茹先古麗·買買提依明，邢軍，艾合買提江·艾海提*，秦新政，劉軍*

1. 新疆大學生命科學與技術學院（烏魯木齊 830017）；2. 新疆農業科學研究院微生物應用研究所（烏魯木齊 830011）

石榴（Punica granatumL.）為石榴科石榴屬落葉灌木或者小喬木，又名安石榴、丹若、金嬰等，是一種珍奇的漿果，原產于伊朗、阿富汗等中西亞地區[1]。它長期以來一直是中東和地中海飲食的一部分。羅馬人稱它為布尼克蘋果[2]。石榴的種植分布于美國、中國、巴西、土耳其等國家。在中國大面積種植于新疆喀什、安徽懷遠、陜西臨潼、四川會理、云南蒙自、山東棗莊等[3]。石榴根據其口感的不同分為甜石榴和酸石榴2個大類，我國的石榴品種有100多種，作為食用的甜石榴就有90多種。石榴的果實器官包括果皮、隔膜、假種皮及石榴籽。假種皮也就是石榴的食用部分，富含水分和花色苷。花色苷含量占比決定假種皮的顏色不同。石榴汁是從假種皮中獲得的主要食品，約占水果總質量的50%[5]。石榴汁呈紅紫色，中等酸性，平均含85.4%的水分和14.6%的干物質。研究發現石榴汁具有抗氧化[6]、抗炎[7]、抗菌[8]、抗骨質疏松[9]、抗癌[10]等生理功效。

為增加果汁的產量及得到營養物質含量豐富的果汁，普遍采用酶解技術對果汁進行加工。孫小華等[11]以果膠酶和纖維素酶進行酶解，無花果的出汁率達到72.15%，相對于未處理的提高75.46%。除了經常在果汁加工使用的酶，如果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等，蛋白酶也逐漸被使用于果汁酶解。孫俊杰等[12]以果膠酶和酸性蛋白酶作為復合酶處理濁橙汁，果汁的出汁率達到83.27%。試驗以果膠酶和木瓜蛋白酶作為復合酶確定澄清石榴汁的最佳酶解條件，并對其工藝采用響應面設計進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴（購于新疆喀什，運回后儲藏于4 ℃冰箱）；果膠酶（上海源葉生物技術有限公司）；木瓜蛋白酶（上海源葉生物技術有限公司）；碳酸鈉（分析純，上海源葉生物有限公司）；氯化鉀（分析純，上海源葉生物有限公司）；乙酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

XY-25B-13B型榨汁機（佛山市南海區九陽廚具廠）；SPECORD PLUS型紫外分光光度計（德國耶拿分析儀器股份公司）；JE3002型電子天平（上海蒲春計量儀器有限公司）；H2-16K臺式高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司）；AUW120型電子天平（島津菲律賓工廠）；DZKW-2-12型數顯恒溫水浴鍋（北京永光明醫療儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 石榴汁酶解工藝

取若干石榴洗凈去皮去除隔膜，用榨汁機壓榨獲得石榴汁。準確稱取25 g石榴汁于錐形瓶中，加入一定量的果膠酶與木瓜蛋白酶（W果膠酶∶W木瓜蛋白酶=1∶1）。將錐形瓶置于水浴鍋中提供相應的條件使其開始酶解。酶解完后于65 ℃滅酶3 min，以8 000 r/min離心8 min獲得上清液即為石榴汁。

1.3.2 酶解單因素試驗

1.3.2.1 酶添加量對石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

設定酶解時間60 min、酶解溫度45 ℃，比較不同復合酶添加量（0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%）對石榴汁澄清度和花色苷含量的影響。

1.3.2.2 酶解時間對石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

設定復合酶添加量0.2%、酶解溫度45 ℃，比較不同酶解時間（30，60，90，120和150 min）對石榴汁澄清度和花色苷含量的影響。

1.3.2.3 酶解溫度對石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

設定酶解時間60 min、復合酶添加量0.2%，比較不同酶解溫度（30，35，40，45和50 ℃）對石榴汁澄清度和花色苷含量的影響。

1.3.3 響應面優化設計

優選單因素試驗的結果，采用Design Expert 11.0進行響應面試驗設計、計算，從而確定最佳復合酶酶解石榴汁工藝，試驗設計因素水平如表1所示。

表1 石榴汁響應面編碼因素水平表

1.3.4 指標的測定

澄清度測定。取離心后的石榴汁上清液在660 nm處測定透光度，純水為對照，以透光率（%）表示。

花色苷含量測定，采用pH示差法。吸取一定的石榴汁，分別用pH 1.0的緩沖溶液（125 mL 0.2 mol/L氯化鉀與375 mL 0.2 mol/L鹽酸混勻）和pH 4.5緩沖溶液（200 mL 1 mol/L乙酸鈉、120 mL 1 mol/L鹽酸和180 mL水混勻）稀釋10倍，分別在510 nm和700 nm下測其吸光度。按式（1）和（2）計算花色苷含量（CGE mg/L）。

式中：A510和A700為果汁在波長510 nm和700 nm下的吸光度；A為不同pH環境下吸光度的差值；MW為矢車菊3-葡萄糖苷的分子量，449.2；F為稀釋倍數，10；ε為矢車菊3-葡萄糖苷的消光系數，26900。

1.4 數據處理

數據采用Excel和Design Expert 11.0進行處理，使用Graph pad prism作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素結果與分析

2.1.1 酶添加量的影響

如圖1所示，隨著復合酶添加量增加，石榴果汁的澄清度呈現先增加后降低趨勢。復合酶添加量達到0.2%時，石榴汁的澄清度達到最高，其平均值為78.53%。酶添加量大于0.2%時，石榴汁的澄清度逐漸降低，這可能是因為酶添加量過大后，隨著大分子物質被分解為小分子物質，如果膠被分解為單糖[13]，如葡萄糖、果糖；蛋白質被分解為小分子肽或者氨基酸類物質。水溶性小分子物質的增多及分子間的相互鍵合形成絡合物也可導致石榴汁的澄清度下降[14]。也可能是因為酶添加量過多，蛋白類物質增多，導致果汁渾濁[15]?；ㄉ蘸侩S著酶添加量增加呈現逐漸降低趨勢，該趨勢與聶銘等[16]的研究結果一致。酶解時花色苷含量從115.322 CGE mg/L降低到93.113 CGE mg/L，降低19.27%?；ㄉ兆鳛榕c顏色表現緊密相關的活性物質，花色苷的降低也就會影響果汁顏色的變化，蔣朵朵等[17]的研究證明花色苷含量的變化與植物本身顏色的變化具有顯著相關性。由此，為獲得澄清型的石榴汁，最佳酶添加量為0.2%。

圖1 酶添加量對石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

2.1.2 酶解時間的影響

如圖2所示，石榴汁的澄清度隨著酶解時間增加呈現先增大后降低趨勢。酶解時間60 min時石榴汁的澄清度達到最大值78.69%。時間小于60 min時，石榴汁的澄清度不高可能是因為酶與底物作用不完全，大分子物質不能完全分解，使得澄清效果不理想。酶解時間超過60 min后澄清度下降可能是由于果汁中的物質發生絡合反應使得果汁的澄清度降低?；ㄉ蘸侩S著酶解時間增加呈現先增加后降低趨勢，最高達到176.270 CGE mg/L。其原因是花色苷作為大分子多酚類化合物，容易發生氧化反應和水解反應，長時間的酶解容易造成花色苷的氧化及水解。因此為了保留更多的花色苷，應該降低酶解時間。綜合考慮，選擇60 min作為最佳酶解時間。

圖2 酶解時間對石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

2.1.3 酶解溫度的影響

如圖3所示，隨著溫度逐漸升高，石榴汁的澄清度呈現先增加后降低趨勢。酶解溫度35 ℃時，石榴汁的澄清度達到最大值。溫度較低時，可能是由于未達到復合酶的最佳溫度，酶解效率降低，使得果汁澄清度不高。溫度大于35 ℃時，澄清度逐漸降低，因為酶的本質為蛋白質，溫度的升高引起酶的活性降低甚至失活，造成石榴汁的澄清度隨著溫度升高而遞減。而花色苷含量變化呈現隨溫度升高而逐漸降低趨勢，由107.840 CGE mg/L降低到94.532 CGE mg/L。其原因是石榴花色苷的耐溫性不高，溫度升高造成花色苷的分解及氧化生成其他化合物，使得花色苷含量降低[18]。因此在使用復合酶酶解石榴汁時最佳酶解溫度為35 ℃。

圖3 酶解溫度對石榴汁澄清度和花色苷含量的影響

2.2 響應面結果與分析

2.2.1 結果與模型建立

根據2.1的試驗結果，按照表1的因素與水平編碼進行Box-Behnken試驗設計，其響應值為石榴汁酶解后的澄清度（Y），試驗結果如表2所示。

由表2的響應面試驗結果，經過Design Expert 11.0軟件二次多項式回歸分析，得到石榴皮澄清度（%）對應的酶添加量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）的回歸曲線方程：Y=-27.255+29.09A+ 0.442 95B+4.720 3C-0.020 833AB+0.975AC-0.000 217BC- 129.975A2-0.002 377B2-0.068 390C2。

表2 復合酶酶解石榴果汁響應面結果表

2.2.2 方差分析以及顯著性檢驗

通常使用F值和P值檢驗回歸方程各因素的顯著性水平，表達各變量間的相互影響大小，P＜0.01表示模型具有極大的可信度。由表3中各F值可判斷各因素對響應值的影響大小，則其影響大小由大到小的排列順序為C＞A＞B。由P＜0.000 1可知該模型可以很高程度對復合酶酶解石榴汁進行模擬，而且該試驗失擬項不顯著（P＞0.05），失擬項一般被用于驗證試驗模型是否與理論模型相符合。由其結果則可知該模型擬合度好，不會造成較高的試驗誤差。

表3 二次多項式回歸方程方差分析和顯著性檢驗結果

同時可根據表3中的P值判斷各因素對澄清結果的影響顯著程度，其中PA=0.019 2（P＜0.05）表示因素A（酶添加量）對澄清度的影響顯著，同理PC=0.008 8（P＜0.01）表示因素C（酶解溫度）對澄清度的影響極顯著，而PB=0.936 4（P＞0.05）則說明因素B（酶解時間）對澄清度的影響不顯著。

2.2.3 響應面分析與優化

對于響應面的分析就是采用平面等高線圖與三維立體圖來分析，平面等高線的曲線越接近于橢圓表示2個因素的交互影響作用越顯著，而在三維立體圖中，曲線的坡度越陡則表示兩個因素的交互影響作用越顯著[19-20]。由表3和圖4可知，交互項AC對響應值Y影響顯著（P＜0.05），剩余交互項AB、BC對響應值Y影響均不顯著。

圖4 響應面各因素交互作用三維圖

2.3 最佳酶解參數及驗證

由試驗模型可知，預測的最佳工藝為復合酶添加量0.214%、酶解時間60.468 min、酶解溫度35.743 ℃，此時石榴汁的透光率為79.954%?；谠囼灥娜菀撞僮餍约疤崛⌒Ч目尚行裕瑢祿{整為復合酶添加量0.22%、酶解時間60 min、酶解溫度35 ℃，此時石榴汁澄清度為77.94%，花色苷含量為174.154 CGE mg/L。理論值與實際數據誤差較小，則可視為該模型與實際擬合良好，可以使用。

3 結論

為獲得澄清型的石榴汁，以酶解工藝對石榴汁進行澄清，測定酶解工藝對石榴汁透光率以及花色苷含量的影響。在單因素試驗基礎上，利用響應面對石榴汁酶解工藝進行優化，獲得與實際較為擬合的模型。最佳石榴汁酶解工藝條件為復合酶添加量0.22%、酶解溫度35 ℃、酶解時間60 min，在此工藝條件下石榴汁的澄清度達到77.94%，花色苷含量為174.154 CGE mg/L。試驗可為石榴汁的加工提供基礎數據。