秋季野生麥苗穗發芽抗性研究及分子標記檢測*

肖磊， 張希太， 董策， 謝淑芹， 藺桂芬

邯鄲市農業科學院 生物技術研究室， 河北 邯鄲 056001

小麥穗發芽是嚴重的氣候災害， 是小麥生產致命性的威脅． 穗發芽災害不發則已， 一發則損失慘重． 據聯合國糧農組織統計， 全世界每年因穗發芽損失20.00%的小麥產量， 幾乎相當于我國小麥的年產量[1]． 我國黃淮麥區、 長江中下游麥區曾多次發生過大面積穗發芽， 西南冬麥區及東北春麥區穗發芽災害也頻繁發生． 我國有85.00%的麥區都存在穗發芽隱患[2]． 小麥穗發芽后不僅產量降低， 最主要的是品質嚴重變劣， 甚至不能食(飼)用． 連續陰雨和潮濕的氣候是穗發芽災害發生的外因， 小麥品種穗發芽抗性差才是內因． 因氣候環境難以控制， 所以培育推廣抗穗發芽的小麥品種是關鍵． 小麥高抗穗發芽種質資源的嚴重匱乏是抗穗發芽育種取得突破的主要阻礙， 也是目前亟待解決的問題．

小麥的抗穗發芽育種一直是我國農業科研的重要領域， 科研工作者對現有的大量小麥品種資源進行了抗穗發芽篩選鑒定， 選出了一些抗性相對較好的品種作為小麥抗穗發芽育種種質資源加以利用； 通過對現有材料的研究， 發現了一些抗性與生理以及抗性與種皮顏色、 穎殼結構等的關系[3-8]， 但受現有小麥品種資源遺傳背景的限制并沒有從根本上找到高抗穗發芽的抗源基因．

國家小麥工程技術研究中心克隆了能抑制小麥穗發芽的“反義硫氧還蛋白基因”并獲得了轉基因小麥材料． 經穗發芽抗性鑒定， 轉基因小麥種子比非轉基因對照的萌動時間明顯延長， 對穗發芽有較強的抑制作用[9-10]． 但該材料是轉基因作物， 特別是目前國家嚴格限制在糧食作物上應用轉基因的形勢下， 該材料在小麥抗穗發芽育種上的應用受到限制； 四川農業大學利用遠緣雜交技術率先將“節節麥”的高抗穗發芽基因引入小麥， 創制出了小麥高抗穗發芽材料RSP[11-14]， 為小麥抗穗發芽育種提供了寶貴的種質資源．

在“一年兩熟”種植模式的黃淮麥區， 小麥收獲后種植大秋作物， 秋季9月底10月初大秋作物收獲后， 冬小麥播種耕地前， 大田中往往生長有少量的剛出土不久的野生麥苗， 這些野生麥苗是由小麥收獲時因粗放操作遺落于大田中的麥粒， 麥穗在土壤中經過了充沛降雨的夏季出土而成， 其種子應該具有很強的休眠特性和抗穗發芽能力， 于是我們通過收集并集中移栽的方式， 對秋后野生麥苗的穗發芽抗性、 種子的休眠特性、 相關抗穗發芽基因的分子標記檢測進行了研究， 旨在為小麥抗穗發芽育種提供具有極強穗發芽抗性的種質資源．

1 材料與方法

1.1 野生麥苗的收集與集中移栽

當年的9月底10月初， 秋收后冬小麥播種耕地前， 對計劃收集地域范圍內的農田進行普查， 將發現的野生麥苗(圖1)進行根部帶土團移栽入觀察圃， 行距20 cm， 株距10 cm， 并進行編號， 記錄收集地點、 移栽時間等． 本試驗野生麥苗的收集地為河北省成安縣商城鎮趙橫城村的部分農田， 集中移栽地為河北省成安縣商城鎮趙橫城村北邯鄲市農業科學院生物技術研究室試驗田． 將野生麥苗集中移栽入觀察圃后， 立即澆水保證移栽苗的成活． 并對觀察圃加強管理， 使移栽成活后的野生麥苗生長茁壯．

圖1 9月底10月初生長于大田中的野生麥苗

1.2 集中移栽的野生麥苗植株農藝性狀調查

調查指標主要有： ① 株高， ② 抗倒性： [1級]不倒伏； [2級]輕微倒伏， 植株傾斜角度A<30°； [3級]中等倒伏， 30°≤A<45°； [4級]較重倒伏， 45°≤A<60°； [5級]嚴重倒伏，A≥60°以上． ③ 抗病性： 在大田中主要目測調查白粉病、 銹病、 葉枯病、 赤霉病4種病害． [1等]無病(沒有4種病害發生)； [2等]輕微發病(有4種病害的1種或幾種發生但較輕)； [3等]發病較重(4種病害的1種或幾種嚴重發生)． ④ 越冬抗凍性： [1級]無凍害； [2級]葉尖受凍發黃； [3級]葉片凍死一半； [4級]葉片全枯； [5級]植株或大部分蘗凍死． ⑤ 分蘗倍數， ⑥ 有效分蘗率， ⑦ 穗粒數， ⑧ 千粒質量等．

1.3 集中移栽野生麥苗麥穗的相對穗發芽指數測定

穗發芽抗性測定參照中華人民共和國農業行業標準《小麥抗穗發芽性檢測方法》(NY/T 1739-2009)[15]進行． 在小麥蠟熟后期， 從田間采取野生單株和對照“泰山1號”植株的主莖穗各10穗， 從穗下莖15～20 cm處剪取． 將剪取的每單株的10個麥穗隨機分成2組， 每組5穗． 先用自來水浸泡4 h， 然后用0.10%的次氯酸鈉溶液消毒5 min， 再用無菌水反復沖洗． 將麥穗插在泡沫塑料板上， 放在人工氣候箱中， 每天模擬降雨噴水2次， 溫度為22 ℃， 相對濕度為100.00%， 培養96 h后立即放在60 ℃的烘箱中烘干． 然后手工剝粒調查統計每組麥穗的發芽粒數(以種子籽粒胚部種皮破裂為發芽標準)和總粒數．

計算穗發芽率(X)

X=N發芽/N總×100%

相對穗發芽指數(I)

I=X1/X2

式中，N發芽為試驗穗發芽粒數，N總為試驗穗總粒數，X1為待測樣品的穗發芽率，X2為對照品種的穗發芽率．

進一步對抗穗發芽級別進行評價(I=0為極抗，I<0.05為高抗， 0.05≤I<0.20為抗, 0.20≤I<0.40為中抗， 0.40≤I<0.60為感，I≥0.60為高感)．

1.4 野生麥苗抗穗發芽種質系的入選標準

根據試驗情況， 把同時符合相對穗發芽指數I<0.05， 株高H≤75 cm， 抗倒性為[1級]， 抗病性為[1等]， 越冬抗凍性為[1級]， 分蘗倍數R≥20， 有效分蘗率ER≥80.00%， 穗粒數N≥35粒， 千粒質量W≥45 g幾項標準的野生麥苗作為種質資源利用， 其余的淘汰．

1.5 野生麥苗抗穗發芽種質系穗發芽抗性測定

將符合本文1.4標準入選的野生麥苗抗穗發芽單株全部種子按株系種植， 行距20 cm， 株距10 cm， 單穴單粒播種． 次年在小麥蠟熟后期， 對入選的野生麥苗抗穗發芽種質系進行穗發芽抗性鑒定． 對麥穗的處理方法和培養條件與本文1.3部分相同， 不同的是： 培養時間為15 d． 從開始培養每間隔24 h調查統計1次各種質系麥穗籽粒的發芽數量， 以籽粒生出種根或長出麥芽為發芽標準． 每天調查后去除已經生根、 發芽的麥粒， 剩下未發芽的籽粒繼續培養直到15 d試驗結束． 計算出每天的穗生根發芽率并制作“時間-穗生根發芽率”曲線．

1.6 野生麥苗抗穗發芽種質系種子的休眠期測定

從小麥蠟熟后期開始， 在25 ℃的室溫下， 對各個野生麥苗種質系的種子， 每間隔3 d進行1次發芽試驗， 96 h后調查發芽率， 當種質系種子的發芽率達到80.00%以上時可認為種子休眠期結束， 即種質系種子發芽率達到80.00%以前的時間為該種質系種子的最長休眠期．

1.7 抗穗發芽基因相關STS分子標記檢測

Vp1B3(F： 5′TGCTCCTTTCCCAATTGG3′； R： 5′ACCCTCCTGCAGCTCATTG3′)是內蒙古農牧大學楊燕等[16]開發的與小麥某些抗穗發芽基因緊密相關的STS分子標記， 利用Vp1B3在抗穗發芽小麥品種中能擴增出845 bp和569 bp兩種片段類型， 而在感穗發芽品種中僅擴增出 652 bp 的片段類型． TaDFRBb(F： 5′GAAATGCGGGGTGACTAGGACTCT3v； R： 5′TATTTCCGTGGCTATTGATTGTTTC3′)是我國開發的與小麥紅皮基因緊密相關的抗穗發芽分子標記， 在紅皮抗穗發芽小麥品種中能擴增出534bp的A型片段和 526 bp 的B型片段[17-19]．

采用CTAB法提取抗穗發芽種質系的基因組DNA， Vp1B3和TaDFRBb引物由上海生工合成． 構建25 μL的PCR反應體系[10×Buffer 2.50 μL+dNTP Mix(2.50 mmol/L)2 μL+上、 下游引物(20 μmol/L)各0.50 μL+Taq酶(5U/μL)0.25 μL+模板DNA 1 μL+ddH2O 18.25 μL]．

PCR反應程序： 94 ℃預變性5 min→94 ℃變性1 min→退火1 min(Vp1B3 60 ℃； TaDFRBb 59 ℃→72 ℃延伸1 min(以前做35次循環)→72 ℃延伸10 min， PCR反應結束． 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物， EB染色后用凝膠成像拍照．

2 試驗結果與分析

2.1 秋后野生麥苗收集移栽統計

由表1知， 當年的9月底10月初生長于田間的野生麥苗， 根部帶土移栽很容易成活， 只要移栽后及時澆水， 移栽成活率為100.00%．

表1 野生麥苗收集移栽統計表

2.2 野生麥苗植株主要農藝性狀調查結果

通過對穩定遺傳的118個野生麥苗單株的主要農藝性狀指標進行調查， 結果顯示(表2)， 野生麥苗植株都比較高， 有65.30%的野生麥苗單株的株高在100 cm以上， 有79.70%的野生麥苗單株的株高在80 cm以上， 20.40%的野生麥苗單株的株高低于80 cm， 只有6.80%的野生麥苗單株的株高不高于75 cm． 野生麥苗單株的抗倒性大部分較差， 有65.30%的野生麥苗單株發生中等及以上倒伏， 21.20%的野生麥苗單株倒伏較輕， 只有13.60%的野生麥苗單株不發生倒伏． 野生麥苗植株的抗病性(白粉病、 銹病、 葉枯病、 赤霉病)普遍較好， 在大田環境中80.50%的野生麥苗植株無病害發生， 只有19.50%的野生麥苗植株輕微發病． 野生麥苗植株的越冬抗凍性都較好， 越冬凍害沒有高于[2級]的單株， 55.90%的野生麥苗植株越冬凍害為[1級]． 野生麥苗植株的分蘗倍數和有效分蘗率都較高， 100.00%的野生麥苗植株的分蘗倍數都大于20倍， 且有效分蘗率都不低于80.00%． 野生麥苗單株的穗粒數較多， 100.00%的野生麥苗單株穗粒數都不低于35粒， 但是野生麥苗單株的千粒質量較小， 在行距20 cm， 株距10 cm， 單穴單粒種植的情況下， 78.80%的野生麥苗單株的千粒質量低于45 g， 只有21.20%的野生麥苗單株的千粒質量不低于45 g．

表2 穩定遺傳的野生麥苗系主要農藝性狀調查統計表

續表2

2.3 野生麥苗株系相對穗發芽指數的測定

分析表3對118個穩定遺傳野生麥苗單株(系)的穗發芽抗性測定數據可知， 野生麥苗的穗發芽抗性普遍較好， 有19.50%的野生麥苗單株的相對穗發芽指數為0， 有78.80%的野生麥苗單株的穗發芽抗性都能達到高抗水平， 只有17.80%和3.40%野生麥苗單株的穗發芽抗性為抗和中抗．

表3 集中移栽的野生麥苗各單株穗發芽抗性的測定結果統計表

2.4 野生麥苗抗穗發芽種質系的篩選結果

根據本試驗制定的野生麥苗抗穗發芽種質系的入選標準， 符合條件的野生麥苗抗穗發芽種質系集合{野生麥苗抗穗發芽種質系}={相對穗發芽指數I<0.05}∩{株高H≤75 cm}∩{抗倒性為[1級]}∩{抗病性為[1等]}∩{越冬抗凍性為[1級]}∩{分蘗倍數R≥20}∩{有效分蘗率ER≥80.00%}∩{穗粒數N≥35粒}∩{千粒質量W≥45 g}={21，46，63，106}， 圖2為穗發芽試驗照片．

圖2 野生麥苗抗穗發芽種質系的穗發芽試驗照片(96 h)

2.5 野生麥苗抗穗發芽種質系的穗發芽抗性測定結果(培養15 d)

由表4和圖3可知， 4個野生麥苗抗穗發芽種質系進行1～15 d的模擬穗發芽試驗時， 對照 “泰山1號”(CK)第2 d就開始在穗上發芽， 第3 d時穗發芽的粒數最多， 第6 d時能發芽的麥粒全部在穗上發芽， 累計穗發芽粒數為376粒， 穗發芽率達到了96.91%， 最后僅剩下12粒由于種子質量的原因未能發芽． 抗穗發芽種質系ZZX21，ZZX63，ZZX106經15 d的模擬穗發芽試驗穗發芽率皆為0， 而且所有的麥粒狀況良好均未發生霉爛． ZZX46在模擬穗發芽試驗的第5～12 d中， 每天有少量的麥粒在穗上生根或發芽， 第12 d時累計穗發芽粒數最多為15粒， 穗發芽率為3.79%， 模擬試驗15 d時未發芽的麥粒狀況良好均未發生霉爛． 經15 d模擬穗發芽試驗， ZZX21，ZZX46，ZZX63，ZZX106 4個野生麥苗抗穗發芽種質系的相對穗發芽指數分別為0，0.039，0，0， 均小于0.05達到高抗級別．

圖3 野生麥苗抗穗發芽種質系模擬穗發芽試驗1～15 d的穗發芽率

表4 野生麥苗抗穗發芽種質系(ZZX)每天累計穗發芽率統計表(培養1～15 d)

2.6 野生麥苗抗穗發芽種質系種子的休眠期測定結果

由表5和圖4可知， 抗穗發芽種質系ZZX21和ZZX46從種子生理成熟(蠟熟期)6月1日開始到7月16日和7月10日時種子發芽率才達到80.00%以上， 休眠時間分別為46 d和40 d． 抗穗發芽種質系ZZX63和ZZX106從種子生理成熟(蠟熟期)6月1日開始到7月31日時種子發芽率才達到80.00%以上， 休眠時間為61 d． 抗穗發芽種質系ZZX21，ZZX46，ZZX63，ZZX106種子都有較長的種子休眠期， 在大田種子生理成熟后， 對連續陰雨的氣候環境引起的小麥穗發芽有很好的抗性． 其最長休眠期通常能在40～60 d結束， 不影響10月初的冬小麥大田播種出苗．

表5 野生麥苗抗穗發芽種質系(ZZX)種子不同時期的發芽率統計表

圖4 不同時期野生麥苗抗穗發芽種質系的種子發芽率曲線

2.7 抗穗發芽基因相關STS分子標記檢測結果

由圖5抗穗發芽分子標記檢測結果可知， 在抗穗發芽種質系ZZX21，ZZX46，ZZX63，ZZX106基因組DNA中未檢測出Vp1B3和TaDFRBb的陽性條帶， 這說明野生麥苗抗穗發芽種質系的相關抗穗發芽基因不屬于和Vp1B3或TaDFRBb緊密連鎖的已知抗穗發芽基因．

1～5泳道為Vp1B3分子標記檢測結果； 6～10泳道為TaDFRBb分子標記檢測結果； 1， 6泳道為100 bp plus DNA ladder(100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000，1 500，2 000，3 000，5 000)； 2， 7泳道為抗穗發芽種質系ZZX21基因組DNA； 3， 8泳道為抗穗發芽種質系ZZX46基因組DNA； 4， 9泳道為抗穗發芽種質系ZZX63基因組DNA； 5， 10泳道為抗穗發芽種質系ZZX106基因組DNA．圖5 抗穗發芽基因相關分子標記檢測結果

3 討論

① “一年兩熟”制的黃淮麥區， 秋后9月底10月初， 冬小麥播種耕地前， 大田中剛出土不久的野生麥苗， 具有很強的抗穗發芽能力， 通過集中移栽， 相對穗發芽指數測定， 有78.80%的秋后野生麥苗穗發芽抗性達到高抗水平， 19.50%的秋后野生麥苗相對穗發芽指數為0， 穗發芽抗性達到極抗水平．

② 本研究通過集中移栽、 綜合農藝性狀調查、 模擬穗發芽試驗等選出了4個野生麥苗抗穗發芽種質系ZZX21，ZZX46，ZZX63，ZZX106， 其相對穗發芽指數分別為0，0.039，0，0， 均達到了極抗穗發芽水平． 其種子的休眠期較長但不影響10月初的冬小麥播種出苗．

③ Vp1B3和TaDFRBb是當前開發最成功也是應用較廣泛的小麥抗穗發芽基因分子標記． 通過這兩種分子標記檢測發現， ZZX21，ZZX46，ZZX63，ZZX106種質系的抗穗發芽基因不屬于與Vp1B3或TaDFRBb緊密連鎖的抗穗發芽基因， 而是新的基因類型．

④ 小麥的穗發芽抗性是由多基因控制的數量性狀， 在這些控制基因中有個別主效基因起著主導作用[20]． 能夠抑制α-淀粉酶活性的基因(如α-淀粉酶抑制蛋白基因等)對小麥穗發芽抗性起著主效基因的主導作用， 因為在小麥穗發芽過程中α-淀粉酶對淀粉的水解起著關鍵的作用． 張海峰等[21]的研究表明， α-淀粉酶的動態變化與穗發芽率的變化完全一致， 呈極顯著正相關． 因此采取各種手段抑制小麥種子內源α-淀粉酶的活性是解決小麥穗發芽問題的關鍵．

⑤ 秋后出土的野生麥苗是由當年5至6月份小麥收獲時因粗放操作遺落于大田中的部分麥粒(穗)在土壤中經過了充沛降雨的夏季， 直到9月底10月初才出土成苗， 其種子具有很強的休眠特性和抗穗發芽能力． 這充分說明了在自然界小麥生產龐大而復雜的群體中存在著抗穗發芽基因型． 通過對秋后野生麥苗的收集與集中移栽， 可以選出高抗穗發芽且綜合農藝性狀較好的抗穗發芽種質資源系， 為小麥抗穗發芽育種提供了寶貴的新種質資源．