同位素稀釋-液相色譜串聯質譜法測定漁用飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留

楊開智，索紋紋，梁 丹，劉伶俐，萬譯文*

（1.常德市畜牧水產事務中心，湖南常德 415000；2.湖南省水產科學研究所，湖南長沙 410153）

氟苯尼考（Florfenicol，FF）又名氟甲砜霉素，是一種新型化學合成酰胺醇類抗菌藥，對革蘭氏陰性菌、陽性菌及支原體有很強的活性，具有很強的抗菌能力（馮民等，2013），因其價格低廉、療效好，曾被廣泛用于動物的疾病防治。氟苯尼考作為氯霉素的替代品被廣泛用于水產品養殖中，水產品中氟苯尼考殘留問題也引起消費者的擔憂，氟苯尼考經代謝后形成多種代謝產物，但大部分以氟苯尼考和氟苯尼考胺的形式存在，GB31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規定，在水產品中，氟苯尼考最大殘留限量（氟苯尼考與氟苯尼考胺之和）為1000μg/kg（仲伶俐等，2021；李雅寧等，2020）。

飼料一般是獸藥添加的主要載體，對漁用飼料中，氟苯尼考及氟苯尼考胺的檢測能從源頭上進行有效控制。目前氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺常用的檢測方法主要有4種，分別為酶聯免疫法（皮江一等，2021；劉智宏等，2010）、氣相色譜質譜法（喬青青等，2021）、高效液相色譜法（馬文瑾等，2020；刁志祥等，2019）和液相色譜串聯質譜法（陳國等，2019；FEDENIUK等，2015；陳濤等，2020）。目前國內對氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的研究主要涉及在雞蛋（曾勇等，2019）、雞肉（張鳳清等，2010）、豬肉（宋菲等，2021；陶晰晨等，2014）和水產品上（邵會等，2015；劉正才等，2015），對飼料中氟苯尼考和氟苯尼考胺同時測定的研究不多，因此，建立一種快速、簡單、同時測定漁用飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺的方法具有重要意義，以便對水產品食用飼料進行有效監控。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑超高效液相色譜串聯質譜儀（配電噴霧離子源），AB Sciex公司；高速冷凍離心機，德國Sigma公司；漩渦混勻儀，德國IKA公司；超聲波清洗器，昆山超聲波儀器廠；24孔氮吹儀，美國organomation公司；平行旋轉蒸發儀，瑞士Buchi（布奇）公司；精密電子天平，梅特勒—托利多稱重設備系統有限公司。

氟苯尼考及氟苯尼考胺標準品，純度均為99.5%以上（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；氘代氯霉素，CAP-D5（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；氘代氟苯尼考胺，FFA-D3（天津阿爾塔科技有限公司）；乙酸乙酯、甲醇、正己烷均為色譜純（德國默克公司）；氨水，分析純（四川西隴化工有限公司）；固相萃取小柱（美國waters公司）；無水硫酸鈉，于450℃下灼燒6h后儲存于干燥器中備用；實驗室用水均為屈臣氏蒸餾水。

1.2 樣品前處理準確稱取粉碎后的飼料樣品2.0 g（精確至0.01 g）至50 mL離心管中，加入0.05 mL CAP-D5和FFA-D3內標溶液（濃度均為100 ng/mL），旋渦混勻，加入0.5 mL氨水和10 mL乙酸乙酯，渦旋混勻后超聲提取10 min，取出后于離心機8000 r/min離心5 min，將上清液轉移至加入5 g無水硫酸鈉的25 mL帶塞離心管中，樣品殘渣繼續加入0.5 mL氨水和10 mL乙酸乙酯后離心，合并2次提取液。取10 mL上清液于45℃水浴中旋轉蒸干。加入4 mL水溶解殘渣，混勻后待凈化。

將上述溶解液轉移至混合陽離子固相萃取小柱中（MCX，500 mg/6 mL），使用前依次用 5 mL甲醇和5 mL水活化，用8 mL水淋洗后抽干，用5 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液。在45℃水浴中氮吹至干，用1 mL甲醇-水（1：9，V：V）定容混勻后過0.2μm濾膜，上機待測。

1.3 色譜條件色譜柱為Capcell Pak ADME（100 mm×2.1 mm，2.7μm）；柱溫為40℃，進樣量為5μL，流動相A為0.05% 甲 酸 -2.0 mmol/L甲酸銨溶液；B為甲醇；采用液相梯度洗脫 程 序 為：0～ 1 min，95%A；1～ 3 min，95%A～ 60%A；3～ 4 min，60%A～ 30%A；3～ 4 min，30% A ～ 10%A；4～ 4.5 min，10%A～95%A，保持3 min。流速為300μL/min。

1.4 質譜條件采用電噴霧離子源（ESI）；正負離子切換掃描；掃描方式為多反應檢測模式（MRM）；噴 霧 電 壓 為 ESI+（4500V）、ESI-（-3500V）；離子源溫度（TEM）為350℃；射入電壓（EP）為 10 V ；離子源氣（GS）為50 psi，其他離子源參數見下表1。

表1 4種目標物的MRM采集參數

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇及優化

2.1.1 提取溶液的選擇 國內對氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的提取采用乙腈和乙酸乙酯的較多（陳濤等，2020）。本文比較了乙酸乙酯-氨水和乙腈兩種提取液，實驗中發現極性強的乙腈提取效率好，但提取液含有大量脂肪、色素等大分子雜質，提取液較渾濁，在凈化處理時容易堵塞固相萃取柱，且在濃縮后，瓶壁上有白色的脂肪等難以溶解的凝結物。氟苯尼考胺屬于堿性化合物，更易溶解于堿性溶液中，氨化后采用乙酸乙酯提取后提取液更澄清，且旋蒸過程中濃縮速度比乙腈快，因此，采用氨水堿化的乙酸乙酯進行提取。

2.1.2 凈化方式及固相萃取柱的選擇 本文采用固相萃取的方式來進行凈化，研究比較了中性氧化鋁柱、HLB柱、C18柱和混合陽離子交換柱（MCX）對漁用飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺的凈化效果和回收率。結果表明，采用HLB固相萃取柱對氟苯尼考胺保留效果較差，回收率只有26.2%，MCX柱對氟苯尼考胺的凈化效果最好，回收率達到90%以上，綜合考慮，本文采用MCX柱對提取液進行凈化。

圖1 不同SPE柱對氟苯尼考及氟苯尼考胺凈化回收率的影響

2.2 色譜條件的選擇及優化試驗比較了乙腈-水、甲醇-水和甲醇-2.0 mmol/L甲酸銨溶液（含0.05%甲酸）3種不同的流動相。乙腈洗脫能力強，氟苯尼考胺屬于極性藥物，出峰時間極短，大概在1 min之內出峰，不利于氟苯尼考胺的保留。當采用甲醇-水作為流動相時，氟苯尼考靈敏度和峰形較好，但氟苯尼考胺峰形不夠尖銳，保留不穩定。在水相中加入揮發性電解質甲酸銨并加入0.05%甲酸控制流動相pH，采用合適的梯度洗脫程序，氟苯尼考及氟苯尼考胺峰形尖銳且對稱性好，增大了兩者離子峰的峰強度。因此，本文采用甲醇-2.0 mmol/L甲酸銨溶液（含0.05%甲酸）為流動相梯度洗脫。如圖2所示。

圖2 空白飼料中5.0μg/kg氟苯尼考及氟苯尼考胺加標樣品離子色譜圖

2.3 質譜條件的選擇及優化采用同位素稀釋法進行定量分析，選用氘代氯霉素作為氟苯尼考內標物，氟苯尼考及氘代氯霉素在ESI負離子模式下進行掃描，形成準分子離子[M-H]-，氟苯尼考胺及氘代氟苯尼考胺在ESI正離子模式下進行掃描，形成準分子離子[M+H]+。在正負離子不同模式下，通過對碰撞能量、去簇電壓等質譜參數進行優化，在二級質譜掃描模式下選取離子豐度強、選擇干擾小的子離子作為定量離子，次強的子離子作為定性離子來滿足藥物分析確診的要求。經過優化后的各化合物質譜參數見表1。

2.4 方法線性范圍、檢出限及定量限吸取適量的混合標準中間液（1.0 mg/L），用經過“1.3 樣品前處理”復溶后的空白基質溶液稀釋，制得基質標準曲線濃度為 5、10、20、50、100、200 ng/mL 的基質標準工作液。通過空白飼料樣品標準加入方法處理后確定方法檢出限和定量限，方法檢出限的信噪比大于等于3，方法定量限的信噪比大于等于10，結果見表2。

表2 線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.5 方法回收率與精密度在市場中購買3種不同品牌的漁用飼料，采取標準添加方法，在空白樣品中加入低、中、高3個濃度水平的混合標準溶液，3個添加水平均做6個平行，同時做對應的樣品空白和試劑空白，按1.3節所述條件進行加標回收率實驗，計算加標回收率和相對標準偏差，結果見表3。由表3可知，該方法回收率和精密度滿足分析方法確診要求，重現性好，適合漁用飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留的測定。

表3 氟苯尼考及氟苯尼考胺在空白樣品中的添加回收率和相對標準偏差（RSDs，n=6）

3 結論

本文通過對前處理條件、色譜條件及質譜條件進行優化，建立了液相色譜串聯質譜法來測定漁用飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留量。方法采用同位素稀釋添加和基質標曲相結合的方式抑制基質效應對氟苯尼考胺的干擾，提高了方法的準確性和重復性。通過方法學驗證，該方法可全面、準確地監測飼料中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留，為政府加強對飼料違規使用獸藥問題的監管提供技術支撐。