流式細胞術檢測孕婦外周血中胎兒紅細胞的應用價值*

崔 瑾，詹 茜，羅 琴，李俊男，張玉洪△

重慶醫科大學附屬第一醫院：1.臨床分子醫學檢測中心；2.產科，重慶 400016

健康的胎盤在母體和胎兒間起轉運營養、氣體和廢物的作用，母體和胎兒各自外周循環中細胞是互相獨立的。當胎盤受損，引起胎兒失血，且胎兒全血進入母體血液循環達到一定量時可引起母親和胎兒發生溶血性反應，即胎母輸血綜合征(FMH)，其發病率和病死率均較高，病情的嚴重性取決于胎兒的失血量[1]。FMH患者早期沒有明顯的臨床癥狀，晚期診斷主要依靠胎動減少或消失，胎心監護出現典型的正弦曲線、胎心基線變異減少及晚期減速，B超檢查顯示胎兒水腫及胎兒生長受限等[2]。因此，FMH早發現極為重要，建立一個快速、準確、客觀評估胎兒失血量的方法非常關鍵。國外幾乎所有(96%)對FMH的確診依靠紙片擴散(K-B)法。血紅蛋白電泳(HBE)檢測胎兒血紅蛋白F(HbF)百分含量也可作為輔助診斷FMH的方法。FMH評估指南指出,隨著流式細胞術(FCM) 的廣泛使用，這項技術已成為診斷FMH的金標準，受限于流式細胞儀，該方法在國內還沒有推廣[3]；同時，熒光素、圈門策略及儀器的靈敏度不同[4]，也會導致檢測結果的變異和缺乏客觀性，每個實驗室在建立該方法時應進行性能確認。本研究先通過抗HbF單克隆熒光抗體滴度試驗找出胎兒紅細胞數量與抗HbF單克隆熒光抗體的最佳反應比，建立FCM檢測胎兒紅細胞的標準化操作步驟，再對該方法的準確度、靈敏度、特異度及重復性進行確認，最后分別采用FCM及HBE對疑似FMH孕婦外周血標本進行胎兒紅細胞和HbF檢測，并將檢測結果與K-B法進行比較，結合患者臨床相關癥狀，明確FCM在FMH診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年10月至2021年7月本院產科90例孕婦作為研究對象，年齡21～36歲，中位年齡27歲，患者自覺胎動減少、超聲多普勒檢查示胎兒大腦中動脈收縮期血流峰值>正常值的1.5倍中位數倍數(MoM)、胎心監護出現典型的正弦曲線、胎心基線變異減少及晚期減速。通過HBE或珠蛋白生成障礙性貧血(簡稱地貧)基因篩查，選出最常見的含有血紅蛋白變異體或地貧相關基因的5份外周血標本，分別含有α-鏈血紅蛋白變體(α-HbV)、β-鏈血紅蛋白變體(β-HbV)、δ-鏈血紅蛋白變體(δ-HbV)、α-地貧相關基因、β-地貧相關基因。

1.2儀器與試劑 主要儀器包括血細胞分析儀(日本希森美康公司)，流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)，血紅蛋白電泳儀(法國賽比亞公司)，顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；主要試劑包括血紅蛋白測定試劑盒(法國賽比亞公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，美國HyClone公司)，25%戊二醛(美國Sigma公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(美國賽默飛公司)，抗人HbF-FITC單克隆抗體(美國賽默飛公司)，磷酸氫二鈉(重慶博藝化學試劑有限公司)，枸櫞酸(成都市科隆化學品有限公司)，伊紅(天津市科密歐化學試劑有限公司)，小牛血清清蛋白(BSA，美國Sigma公司)，乙醇(重慶川東化工集團有限公司)。

1.3方法

1.3.1FCM 采用FCM檢測胎兒紅細胞百分比(fetal-RBC)。血細胞分析儀計數EDTA抗凝臍帶血和孕婦外周血紅細胞數量后，選擇紅細胞數量和血紅蛋白含量相似的2個樣品，按照抗體說明書制備臍血和孕婦血紅細胞懸液，并使其終濃度為(4～6)×104/μL，然后按比例混合上述紅細胞懸液，得到一系列fetal-RBC理論值(THV)為100%、25%、8%、5%、2%和0%的混合紅細胞懸液；加1～5 μL紅細胞懸液、4～8 μL 抗HbF抗體和70 μL PBS/BSA(0.1%)到流式管中，室溫避光孵育15 min，再加入2 mL PBS/BSA 渦旋混勻后以600×g離心5 min，最后移除上清液并加入0.5 mL PBS/BSA重懸紅細胞上機檢測[5]。

1.3.2K-B法 采用K-B法檢測fetal-RBC。按常規制備血涂片，自然干燥>10 min，80%乙醇固定5 min，水洗待干，將固定后的血涂片在37 ℃的酸性緩沖液(0.2 mol/L磷酸氫二鈉12.3 mL、0.1 mol/L枸櫞酸37.7 mL、pH值為3.3±0.2)中洗脫8 min，沖洗干燥；在10 g/L伊紅染液中染色1 min，水洗待干后，計數1 000個紅細胞中胎兒紅細胞數量[6]，胎兒紅細胞為紅色，成人紅細胞為無色淡影。

1.3.3HBE 采用HBE檢測HbF。血紅蛋白電泳儀開機自檢結束后，檢測血紅蛋白A2(HbA2)和HbF質控標本，室內質控通過后將待測標本推入進樣倉進行外周血HbF檢測。

2 結 果

2.1FCM檢測胎兒紅細胞數量方法的建立 按試劑說明書推薦5 μL抗HbF單克隆熒光抗體可染色2×105個紅細胞，上機檢測結果不佳。為檢測抗體的效價，采用THV為25%且胎兒紅細胞數量約為5×104個臍血和孕婦血混合紅細胞懸液，分別與3、4、5、6和7 μL抗HbF單克隆熒光抗體反應，上機檢測fetal-RBC為(23.33±0.33)%，胎兒紅細胞數量與成人紅細胞數量平均熒光強度差(ΔMFI)為10.65～55.52(圖1A)。為進一步驗證抗原抗體最適反應比，取1 μL臍血紅細胞懸液(含胎兒紅細胞5×104個)分別與5、6、7和8 μL抗HbF單克隆熒光抗體反應，抗體量為5～6 μL時，fetal-RBC及熒光強度(MFI)升高幅度最大，但隨著抗體量增加，MFI緩慢增加，而fetal-RBC開始降低(圖1B)。綜合考慮后，fetal-RBC和MFI在后續試驗中均按胎兒紅細胞數量與抗HbF單克隆熒光抗體比為5×104個∶6 μL進行熒光抗體染色。

注：A為混合紅細胞懸液中fetal-RBC理論值為25%；B為臍血紅細胞懸液中fetal-RBC理論值為100%。圖1 不同劑量抗HbF抗體染色后FCM檢測fetal-RBC及MFI

2.2FCM檢測胎兒紅細胞方法性能驗證 分別采用FCM、HBE及K-B法檢測fetal-RBC理論值(THV)為25%、8%、5%、2%的臍血和孕婦混合血紅細胞懸液，3種方法準確度比較，差異無統計學意義(P>0.05)，THV與FCM、FCM與HBE、FCM與K-B法fetal-RBC理論值與實測值比較，差異均無統計學意義(P=0.591、0.217、0.286)(圖2A)。同時采用FCM檢測值(Y)與理論值(X1)及HBE檢測值(X2)分別進行直線回歸分析，得到Y=0.969X1+0.426(R2=0.999 95)和Y=1.185X2-0.229(R2=0.999 76)。

檢測靈敏度和流式細胞儀收集的總細胞數密切相關，總細胞數越多，靈敏度越高。引入反應體系的總紅細胞量數最少為5×104個，儀器收集到30個及以上信號數為有效細胞群，該方法檢測胎兒紅細胞的最低靈敏度為0.06%，隨著參加反應總紅細胞數量增加，相應的檢測靈敏度也不斷提高，見表1。

表1 FCM檢測胎兒紅細胞的靈敏度評價實驗

采用FCM對含有α-HbV、β- HbV、δ- HbV、α-地貧伴HbCs外周血進行fetal-RBC檢測，結果均<0.68%，見表2。值得注意的是，對于β-地貧伴HbF升高的成人外周血，FCM檢測到30.08% HbF弱陽性，即MFI較低的紅細胞(F-RBC)(圖2B)，而HBE檢測到HbF 相對含量僅為10.6%，通過比較FCM和HBE結果，可以將fetal-RBC與F-RBC明確區分開來。

表2 FCM檢測胎兒紅細胞的特異度評價實驗

注：A為FCM、HBE、K-B法的理論值與實測值比較；B為FCM檢測β-地貧伴HbF升高患者外周血的fetal-RBC；C為90 d內fetal-RBC高、中、低水平的5次FCM檢測值。圖2 FCM檢測胎兒紅細胞方法的準確性、特異度及重復性驗證

由于FCM分析對象為活細胞，為了避免自然凋亡造成的計數降低，將外周血標本制成固定好的紅細胞懸液并儲存在4 ℃，在90 d內進行了5次fetal-RBC檢測，高、中、低3種水平的變異系數(CV)分別為1.36%、3.22%、7.00%，均小于10.00%(圖2C)。

2.3FCM檢測胎兒紅細胞和HBE檢測HbF 將K-B法檢測胎兒紅細胞百分比大于 0.68%暫定為FMH診斷標準，對90例疑似FMH孕婦外周血標本進行FCM和HBE聯合檢測：82例孕婦外周血標本聯合檢測均為陰性，排除FMH診斷；各有3例孕婦外周血標本單檢陽性，結合地貧基因篩查結果，判定為假陽性；2例孕婦外周血標本聯合檢測均為陽性，確診為FMH。

2.4診斷FMH病例2例 1例患者孕40周，胎心監護異常6 h后采集外周靜脈血進行FMH檢測，結果如下：FCM檢測fetal-RBC為6.09%，MFI為56.78(圖3A)，HBE檢測HbF百分含量為4.90%(圖3B)，隨后進行K-B 法驗證，K-B法計數為6.30%(圖3C)，3項檢測結果一致，均提示FMH發生，醫生對患者緊急進行剖宮產，產下1名活胎男嬰，Apgar評分為8分(膚色扣1分、肌張力扣1分)-10-10分。另1例患者孕39周，腹痛2 h，堅持順產，常規子宮收縮近5 h，順產分娩一活女嬰，Apgar評分6分(膚色扣2分，呼吸扣1分，肌張力扣1分)-7分(膚色扣2分，呼吸扣1分)-7分(膚色扣2分，呼吸扣1分)，并進行FMH相關檢測，fetal-RBC為6.57%，HbF為4.90%，根據公式估計胎兒失血量為230 mL，考慮存在新生兒貧血轉入新生兒科。

注：A為FCM檢測到胎兒紅細胞-右側峰，MFI為56.78；B中箭頭所指的中間峰代表HbF，含量為4.90%；C為伊紅染色陽性的胎兒紅細胞及伊紅染色陰性的成人紅細胞。圖3 1例FMH陽性病例檢測結果

2.5除外FMH診斷病例1例 孕婦27歲，妊娠12周后開始常規產前檢查，HBE屢次發現HbF升高。最近1次HBE結果：HbF為6.40%，HbA2為2.1%(圖4A)，血常規檢測結果如下：紅細胞計數為3.56×1012/L，血紅蛋白為120 g/L，血細胞比容為36.10%，平均紅細胞體積為101.4 fL，平均紅細胞血紅蛋白含量為33.7 pg，平均紅細胞血紅蛋白濃度為332.0 g/L。產科醫生建議孕婦先進行地貧基因篩查，基因位點包含α-地貧的153個突變和4個常見缺失，β-地貧的348個突變和3個常見缺失，未見陽性結果；再進行FMH實驗室檢查，FCM未檢測到胎兒紅細胞(圖4B)，但F-RBC百分比高達38.93%，MFI為12.29，與HBE檢測的HbF含量相差較大。隨后對該患者標本行針對α基因稀有缺失、α三聯體和血紅蛋白持續增多癥相關的DNA凝膠電泳，得出此患者是存在αααanti4.2的α-地貧患者(圖4C)，這就解釋了孕婦HbF百分比增高的原因。

注：A中箭頭所指的中間峰代表HbF，百分含量為6.40%；B為FCM檢測到的右側峰，為HbF弱陽性紅細胞，MFI為12.29；C為基因檢測結果，左邊5道分別為DNA標志物、αααanti3.7和αααanti4.2陰性對照和陽性對照；右邊2道為待測樣品αααanti3.7和αααanti4.2的檢測結果。圖4 1例排除FMH的αααanti4.2地貧病例檢測結果

3 討 論

FMH發病機制或誘因目前不清楚，中度到嚴重程度的FMH發病率估算為每1 000個新生兒出現1～3個[7-9]。FMH的流行病學調查缺乏大量數據的前瞻性研究，同時部分產科醫生對其警惕程度不夠均導致該病現有發病率比實際情況低很多[1]。有研究支持對急性腹部創傷的孕婦，若出現新生兒貧血、胎兒宮內發育遲緩、胎兒水腫及不明原因死胎均應及時開展FMH篩查[10-11]。本研究共檢測90例臨床懷疑FMH的孕婦外周血標本，確診FMH 2例，陽性率為2.22%，遠遠高于其估算的發病率，提示對于出現胎兒宮內貧血的孕婦很大一部分可能漏診了FMH。因此，有必要將FMH的確診試驗作為常規產前檢查項目，以便能夠及時發現早期FMH，避免晚期出現嚴重后果；同時對這類病例的積累，也為FMH的流行病學研究提供了臨床參考數據。

K-B法檢測胎兒紅細胞已有60年歷史，它是利用HbF不被酸洗脫的原理使胎兒紅細胞顯紅色，成人紅細胞為無色淡影，最初主要用來評估Rh陰性孕婦預防性抗RhD免疫球蛋白的使用劑量，因此，只對Rh陰性孕婦做該檢查。因其成本低，不需要特殊儀器，目前仍是大部分中國醫生診斷FMH的首選實驗室方法，待產婦胎兒紅細胞百分含量參考值范圍小于0.68%，但手工操作(如血片厚度、干燥度及酸性緩沖液洗脫時間等)均會影響胎兒紅細胞染色[10]，結果判定主觀性強，重復性差，在不同實驗員或實驗室間檢測結果差異較大，而且當孕婦紅細胞存在耐酸的血紅蛋白變異體，或存在如β-地貧、鐮刀型細胞貧血、遺傳性持續性胎兒血紅蛋白綜合征等造成F-RBC比例升高的血紅蛋白病時，K-B法檢測會出現假陽性[12-13]。HBE檢測的是紅細胞溶血后各血紅蛋白組分的百分比，成人紅細胞僅有非常少量甚至沒有HbF(0～2%)，胎兒紅細胞主要組分即HbF，然而25%的孕婦從懷孕8周起紅細胞HbF開始增加，到孕32周時HbF百分含量可高達7%[3]，因此，HBE雖可以輔助診斷FMH[14]，但不能確診。與K-B法比較，FCM檢測操作簡單，省時、省力，該法基于胎兒紅細胞含70%以上的HbF，健康成人紅細胞含90%以上的HbA，利用抗HbF單克隆熒光抗體特異性標記胎兒紅細胞中的HbF，而不與母血紅細胞中的HbA或其他血紅蛋白變異體反應，從而準確測定胎兒紅細胞在母血紅細胞中的百分比，且流式細胞儀可在短時間內收集數萬至數十萬個細胞信號，檢測靈敏度及重復性較高[10,15]，結果客觀穩定，是臨床確診FMH的實驗室檢測發展方向。

本研究對臨床90例疑似FMH的孕婦外周血標本分別進行FCM和HBE兩種方法檢測，93.33%(84/90)的結果具有一致性。其中3例標本FCM結果為胎兒紅細胞百分含量偏高，而HBE結果顯示紅細胞裂解液中主要為HbA和HbA2，HbF相對百分含量較低，其原因可能是沒有采用新鮮臍血作為陽性對照，流式細胞儀每天的flowcheck雖然合格，但光路同前次還是有少許差異，因而造成FCM檢測后結果為假陽性；另外3例檢測結果不一致的情況是FCM僅檢測到HbF弱陽性的F-RBC，未檢測到HbF強陽性的胎兒紅細胞，HBE結果為HbF>2%且HbA2>3.5%，因為HbA2>3.5%是β-地貧患者HBE的典型表現，相對高水平的HbF也是地貧表現之一[16]，經過地貧基因檢測，3例患者均確診為伴HbF升高的β-地貧。因此，本研究在后續進行FMH確診試驗時，均采用FCM和HBE兩種方法，并且每次FCM檢測需加新鮮臍血作為陽性對照，以確定陰陽界限。

值得注意的是，母血中胎兒紅細胞數量主要和以下3個因素有關，胎兒失血量、出血時間及母血中是否存在胎兒紅細胞抗體，出血時間太久或母血中存在針對胎兒紅細胞的抗體，均可導致檢測結果偏低甚至假陰性。因此，檢測時機非常重要。本研究2例FMH患者，1例患者采用FCM及HBE聯合檢測確診為FMH后及時行剖宮產，胎兒情況良好，另1例孕婦腹痛發生后堅持順產，醫生對FMH的警惕性不足，未及時進行檢測，新生兒貧血嚴重，情況較差。FCM及HBE聯合檢測操作簡單，檢測時間短，孕婦僅需提供1 mL抗凝外周血，即可對外周血中胎兒紅細胞數量進行動態監測，為FMH篩查納入大規模常規產前檢查提供了可能性。重慶作為全國地貧高發地區之一，FMH篩查同樣也能為稀有基因型地貧的鑒別診斷提供新證據。而且ABO血型相容的胎兒紅細胞與成人外周血紅細胞的壽命相同[17]，對于分娩時出現胎兒窘迫或貧血的產婦在生產4個月內均可采集外周血進行FMH篩查找到原因。

綜上所述，本研究建立了FCM檢測FMH的非創傷性產前診斷方法，其聯合HBE檢查，不但可以動態監測評估宮內胎兒出血量，而且為后續治療方案的調整提供依據，改善了胎兒不良預后。