急性胰腺炎患者外周血ATG5、miR-30-5p水平與患者病情嚴重程度及預后的關系*

陳晨暉，程 楠，彭 偉，李 勇，李可可，徐內衛，鄭永強

1.湖北省宜昌市第二人民醫院/三峽大學第二人民醫院急診內科，湖北宜昌 443000；2.湖北省宜昌市第五人民醫院超聲科，湖北宜昌 443000；3.湖北省宜昌市第二人民醫院/三峽大學第二人民醫院肝膽胰外科，湖北宜昌 443000；4.湖北省宜昌市第二人民醫院/三峽大學第二人民醫院消化內科，湖北宜昌 443000；5.湖北省宜昌市第二人民醫院/三峽大學第二人民醫院神經內科，湖北宜昌 443000

急性胰腺炎是一類胰腺內消化酶前體異常活化導致胰腺分泌功能紊亂的疾病，近年來其發病率呈現逐年升高的趨勢[1]。急性胰腺炎患者病情復雜，容易引起感染性休克，且常常會伴有炎癥和器官衰竭現象發生，使得此病的病死率較高[2-3]。因此，尋找可以早期評估急性胰腺炎病情嚴重程度及預后的指標意義重大。自噬是一個復雜的生理過程，可以消除錯誤折疊的蛋白及受損的細胞器，進而維持細胞的穩態[4]。哺乳動物細胞中的自噬體涉及自噬蛋白相互協同作用，其中自噬相關蛋白5(ATG5)是參與調控細胞自噬過程的重要自噬蛋白[5]。微小RNA-30-5p(miR-30-5p)為微小RNA(miRNA)家族成員之一，有研究表明miR-30-5p參與控制細胞周期進程及腫瘤的形成，在腫瘤的發生及發展中扮演著腫瘤細胞抑制角色[6-7]，但其在急性胰腺炎中如何表達，并如何影響急性胰腺炎的發生與發展，目前尚不清楚。因此，本研究分析了急性胰腺炎患者外周血中ATG5及miR-30-5p的水平，以及二者與患者病情嚴重程度及預后的關系，以期為急性胰腺炎的臨床診治提供有價值的理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2020年6月湖北省宜昌市第二人民醫院(以下簡稱本院)急診科收治的急性胰腺炎患者200例為研究對象，男118例，女82例；年齡35～70歲，平均(50.67±9.29)歲。(1)納入標準：①年齡>18歲；②在研究開始前3個月未進行過相關治療；③患者臨床資料完整；④均符合《急性胰腺炎診治指南(2014)》[8]中的診斷標準。(2)排除標準：①合并外傷；②妊娠期女性；③合并其他疾病或者惡性腫瘤；④患有其他免疫功能缺陷疾病。按照2012年制定的急性胰腺炎嚴重程度標準[9]將200例患者分為輕癥組122例和重癥組78例；根據治療4周后的預后情況將患者分為死亡組28例和存活組172例。選取同期本院體檢健康者90例為對照組。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患者知情且簽署同意書。

1.2儀器與試劑 TL988實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀購自西安天隆科技有限公司；SMZ745尼康光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司。所用試劑包括RNA提取試劑盒(批號：DP315，北京天根生化科技有限公司)、反轉錄試劑盒(批號：QP056，美國Genecopoeia公司)、qRT-PCR檢測試劑盒(批號：QP115，美國Genecopoeia公司)。引物(批號：20180724)由上海生工生物工程有限公司提供。

1.3方法

1.3.1標本采集 采集急性胰腺炎患者入院后第2日及健康體檢者體檢當日清晨空腹外周血5 mL，3 500 r/min離心10 min，收集上層血清保存于—20 ℃冰箱中待測。

1.3.2qRT-PCR檢測外周血ATG5、miR-30-5p水平 按照RNA提取試劑盒說明書對血清進行RNA提取。根據qRT-PCR檢測試劑盒說明書配制實驗反應體系，設定反應條件(94 ℃預變性15 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環)。分別以甘油酸-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和U6為內參，采用2-ΔΔCt計算法對血清中ATG5、miR-30-5p水平進行相對定量分析。ATG5、miR-30-5p、GAPDH和U6引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3臨床資料收集 記錄研究對象的年齡、性別、體質量指數(BMI)、吸煙史、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、脂肪酶、C反應蛋白(CRP)、急性胰腺炎嚴重程度床邊指數(BISAP)及急性生理與慢性健康評估系統Ⅱ(APACHEⅡ)評分等資料。

2 結 果

2.1輕癥組、重癥組及對照組基線資料比較 重癥組、輕癥組、對照組年齡、性別、BMI、有吸煙史者所占比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。重癥組、輕癥組TC、TG、LDL-C、脂肪酶、CRP、APACHEⅡ評分明顯高于對照組，HDL-C水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；重癥組TC、TG、LDL-C、脂肪酶、CRP、APACHEⅡ評分、BISAP評分明顯高于輕癥組，HDL-C水平明顯低于輕癥組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 輕癥組、重癥組及對照組基線資料比較

組別nHDL-C(x±s,mmol/L)LDL-C(x±s,mmol/L)脂肪酶(x±s,U/L)CRP(x±s,mg/L)BISAP評分(x±s,分)APACHEⅡ評分(x±s,分)輕癥組1222.05±0.30*3.26±0.48*547.16±67.34*29.48±1.22*3.68±0.4310.41±1.56*重癥組781.37±0.29*#3.74±0.56*#896.52±74.86*#44.69±4.97*#4.14±0.45#11.39±1.68*#對照組902.87±0.323.04±0.56156.23±20.6513.32±1.38—6.88±0.84F/χ2/t515.36238.1553 249.7332 632.2167.173248.665P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.2輕癥組、重癥組及對照組外周血ATG5、miR-30-5p水平比較 與對照組比較，輕癥組和重癥組外周血中miR-30-5p水平明顯降低，ATG5水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與輕癥組比較，重癥組外周血中miR-30-5p水平明顯降低，ATG5水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 輕癥組、重癥組及對照組外周血ATG5、mir-30-5p水平比較

2.3急性胰腺炎患者外周血ATG5與miR-30-5p水平的相關性 Pearson相關分析結果顯示，急性胰腺炎患者外周血中ATG5與miR-30-5p水平呈負相關(r=—0.568，P<0.001)。

2.4存活組、死亡組與對照組外周血ATG5、miR-30-5p水平比較 與對照組比較，存活組和死亡組外周血中ATG5水平明顯升高，miR-30-5p水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與存活組比較，死亡組外周血中ATG5水平明顯升高，miR-30-5p水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 存活組、死亡組與對照組患者外周血ATG5、miR-30-5p水平比較

2.5ATG5、miR-30-5p水平與急性胰腺炎患者預后的關系 以急性胰腺炎患者ATG5、miR-30-5p水平平均值進行分組，分為ATG5高表達組(>1.22，98例)和ATG5低表達組(≤1.22，102例)，miR-30-5p高表達組(>0.90，104例)和miR-30-5p低表達組(≤0.90，96例)。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，ATG5高表達組生存率(78.57%)明顯低于ATG5低表達組生存率(93.14%)，差異有統計學意義(χ2=8.896，P=0.003)；miR-30-5p高表達組生存率(94.23%)明顯高于miR-30-5p低表達組生存率(77.08%)，差異有統計學意義(χ2=12.425，P<0.001)。

3 討 論

胰腺炎表現為胰腺整體或者局部出現壞死、水腫、出血，該病的病情較復雜且臨床表現差異也較大[10-11]。急性胰腺炎是外科常見的危急炎癥，若不及時采取有效的治療，輕度急性胰腺炎會發展成為重度急性胰腺炎，嚴重時可致患者死亡[12-13]。急性胰腺炎發病與胰腺損傷后，胰酶大量釋放，從而對自身組織產生破壞，繼而會引發相關的炎性反應與免疫反應有關。在臨床較為常見的是輕癥急性胰腺炎，如果病情惡化成為重癥急性胰腺炎，則預后不佳且病死率較高[14-15]。本研究檢測了急性胰腺炎患者的相關指標，發現重癥組、輕癥組TC、TG、LDL-C、CRP、脂肪酶、APACHEⅡ評分明顯高于對照組，HDL-C水平明顯低于對照組；與輕癥組比較，重癥組TC、TG、LDL-C、CRP、脂肪酶、APACHEⅡ評分、BISAP評分明顯升高，HDL-C水平明顯降低，提示急性胰腺炎患者體內存在不同程度的血脂異常和炎性反應，胰腺受到損傷。

miRNA作為一類長度大概為22個核苷酸的由內源基因編碼的非編碼單鏈RNA，在細胞內具有多種重要的調節作用，每個miRNA都具有多個靶基因，在基因的表達調控、細胞的分化、細胞炎癥及細胞凋亡等方面都發揮功能，也有研究證明其在腫瘤的發生過程中具有重要作用[16]。昝玲玲等[17]通過研究發現，miR-30-5p在乳腺癌細胞中的水平下降，并通過某種途徑控制著乳腺癌的發展過程。諸葛雪朋等[18]的研究證明miR-30-5p在食管癌組織中的水平明顯下調，說明miR-30-5p具有抑制腫瘤生長的作用。本研究發現，與健康體檢者相比，急性胰腺炎患者外周血中miR-30-5p水平明顯降低，且與輕癥急性胰腺炎患者比較，重癥急性胰腺炎患者外周血中miR-30-5p水平明顯降低。此外，對急性胰腺炎患者預后進行分析發現，死亡組外周血中miR-30-5p水平明顯低于存活組，說明miR-30-5p參與了急性胰腺炎的發生，可能對疾病的發生、發展存在著一定調控作用，其水平的異常變化增加了急性胰腺炎的患病風險，且影響患者的預后。

在眾多自噬相關基因中，ATG5被研究證明是巨自噬和微自噬的重要標志[19]，參與自噬體膜的擴張及伸展，以及最終包裹內容物形成自噬體的整個過程，被廣泛作為自噬體相關研究中的研究對象。ATG5不僅可以促進細胞的自噬形成，而且具有刺激細胞凋亡的作用，在動物的神經保護、生殖發育及先天免疫等過程中起著重要的作用[20]。韓莎等[21]的研究證明ATG5在甲狀腺乳頭狀癌患者中表達異常，證明其可能參與了癌細胞的生長及轉移過程。本研究結果發現，與對照組比較，輕癥組和重癥組外周血中ATG5水平明顯升高，且與輕癥組比較，重癥組外周血中ATG5水平明顯升高。此外，與存活組相比，死亡組外周血中ATG5水平明顯升高，這些結果表明ATG5與急性胰腺炎的發生及進展密切相關，可能由于ATG5水平的異常變化刺激了機體生物學變化，對疾病的發生起到了促進作用，其水平越高，病情越嚴重，預后也越差。

本研究通過Pearson相關分析發現，在急性胰腺炎患者外周血中ATG5與miR-30-5p水平呈負相關，推測miR-30-5p、ATG5可能通過靶向調控關系共同影響著急性胰腺炎患者的預后，但具體作用機制尚待進一步證實。同時，本研究進行了生存分析，發現ATG5低表達和miR-30-5p高表達患者具有更高的生存率，說明檢測ATG5、miR-30-5p水平對急性胰腺炎患者預后有一定評估價值，臨床應密切關注高水平ATG5和低水平miR-30-5p患者，并及時干預，從而減少急性胰腺炎死亡患者。

綜上所述，miR-30-5p在急性胰腺炎患者中低表達，ATG5在急性胰腺炎患者中高表達，且二者均與急性胰腺炎患者病情嚴重程度及預后有關，是評估急性胰腺炎患者預后的潛在標志物。