福州地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性分析及方法學(xué)比較*

吳貽晨，陳 點(diǎn)，王堯城，4,余 鴻，賴 力，黃 毅，4

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，福建福州 350001；2.福建省立醫(yī)院司法鑒定所，福建福州 350001；3.福建省心血管病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350001；4.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建福州 350001

細(xì)胞色素P450(CYP450)是一類在450 nm處有特異性吸收峰的亞鐵血紅素蛋白家族成員，是一組參與生物轉(zhuǎn)化與代謝的重要同工酶。CYP2C是CYP450的主要成分之一，約占總量的20%，其中CYP2C19參與體內(nèi)多種藥物代謝，包括氯吡格雷等抗凝藥物、三環(huán)類抗抑郁藥物、抗癲癇藥物、降糖藥物及一些抗精神病藥物等[1]。有研究報(bào)道，CYP2C19基因多態(tài)性對相關(guān)藥物的用量與療效具有重要影響，患者的藥物代謝率與有效劑量表現(xiàn)出明顯的個(gè)體差異[2]，因此開展CYP2C19基因多態(tài)性檢測對指導(dǎo)臨床用藥具有重要的參考意義。本研究擬采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與熒光PCR毛細(xì)管電泳法分別對福州地區(qū)漢族人群的CYP2C19基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，對兩種方法檢測結(jié)果的一致性進(jìn)行檢驗(yàn)，并通過計(jì)算CYP2C19基因的等位基因、基因型及藥物代謝類型的頻率，探討福州地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性分布及其與氯吡格雷代謝類型的相關(guān)性，為臨床上開展CYP2C19基因快速檢測與氯吡格雷用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年3-7月在福建省立醫(yī)院進(jìn)行CYP2C19基因檢測的324例福州地區(qū)漢族人群為研究對象。所有研究對象3代內(nèi)均為長期居住在福州地區(qū)的漢族人群，自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 基因組DNA提取采用全血基因組核酸提取試劑盒(離心柱法，武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司)。采用NanoDrop1000型超微量紫外分光光度計(jì)(美國Thermo公司)對DNA提取液的濃度和純度進(jìn)行檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測采用人類CYP2C19基因檢測試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司)和SLAN-96R型熒光定量PCR擴(kuò)增儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)；熒光PCR毛細(xì)管電泳法檢測采用CYP2C19基因檢測試劑盒(北京閱微基因技術(shù)股份有限公司)、Veriti PCR擴(kuò)增儀(美國AB公司)及3130型基因分析儀(美國AB公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及資料收集 抽取所有研究對象靜脈全血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，-20 ℃保存。所有研究對象均詢問家族史和民族、籍貫。

1.3.2基因組DNA提取 取200 μL抗凝全血，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，獲得全血基因組DNA提取液100 μL，-20 ℃保存。采用紫外分光光度計(jì)測得DNA提取液濃度均大于10 ng/μL，吸光度(A)260/280為1.8～2.0。取抗凝全血1 μL，采用熒光PCR毛細(xì)管電泳法免提取直接擴(kuò)增。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測 根據(jù)所檢測的CYP2C19基因分別配制3個(gè)PCR反應(yīng)體系：在3個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17反應(yīng)液各23 μL，每管分別加入模版DNA 2 μL，每管PCR反應(yīng)總體系為25 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：(1)UNG處理37 ℃，10 min。(2)變性95 ℃，5 min。(3)擴(kuò)增95 ℃，15 s；62 ℃，60 s；40個(gè)循環(huán)，在62 ℃時(shí)讀取熒光信號。CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17 3個(gè)等位基因的“野生型”和“突變型”引物均使用FAM和VIC熒光探針分別進(jìn)行標(biāo)記，以ROX熒光探針標(biāo)記內(nèi)標(biāo)基因進(jìn)行質(zhì)量控制。每個(gè)反應(yīng)管分別根據(jù)檢測出的熒光探針信號的Ct值判定檢測結(jié)果是否為“純合野生”“雜合突變”及“純合突變”等情況，以確定CYP2C19基因的等位基因和基因型。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17 3個(gè)反應(yīng)管中僅“野生型”探針陽性表示該基因沒有發(fā)生突變，為純合野生；而僅“突變型”探針陽性則表示該基因發(fā)生了純合突變；當(dāng)“野生型”和“突變型”探針同時(shí)陽性表示該基因突變類型為雜合突變。CYP2C19*1為編碼正常酶活性的基因，當(dāng)未檢出純合突變型等位基因或未同時(shí)檢出兩個(gè)雜合突變型等位基因時(shí)可標(biāo)記為CYP2C19*1。

1.3.4熒光PCR毛細(xì)管電泳法檢測 熒光PCR毛細(xì)管電泳法通過FAM熒光標(biāo)記CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17等位基因的“野生型”及“突變型”引物。根據(jù)檢測體系說明書構(gòu)建20.0 μL復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系，具體配制如下：PCR反應(yīng)液10.0 μL，引物混合液2.0 μL，模板DNA或全血1.0 μL，酶混合液0.5 μL，無核酸酶純水補(bǔ)足至20 μL。毛細(xì)管電泳法PCR擴(kuò)增程序如下：(1)消化50 ℃，10 min。(2)變性95 ℃，5 min。(3)擴(kuò)增94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30個(gè)循環(huán)。(4)延伸72 ℃，5 min。(5)低溫保存4 ℃。制備10.0 μL毛細(xì)管電泳樣品(包括8.5 μL去離子甲酰胺HiDi、0.5 μL分子內(nèi)標(biāo)ROX500和1.0 μL PCR產(chǎn)物)，并按照相應(yīng)條件進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，通過Data collection V3.0軟件收集熒光信號，在GeneMapper V3.2軟件上分析CYP2C19基因等位基因和基因型。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段長度及電泳遷移率不同，CYP2C19*3、CYP2C19*17和CYP2C19*2等位基因片段在電泳分型圖譜上按從小到大排列，通過分析軟件對照DNA片段峰形標(biāo)準(zhǔn)圖譜將“野生型”峰形標(biāo)記為“WT”，“突變型”峰形則用相應(yīng)等位基因名稱標(biāo)記，其中CYP2C19*3等位基因片段長度最小，CYP2C19*2等位基因片段長度最大。CYP2C19*1等位基因的判斷方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法一致。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，兩種方法一致性比較采用Kappa檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩種方法一致性分析 選取100例研究對象的CYP2C19基因分型檢測結(jié)果對兩種方法的一致性進(jìn)行驗(yàn)證，兩種方法的基因分型結(jié)果一致性為100%(Kappa=1.000，P<0.05)。兩種方法的基因分型結(jié)果見表1。

表1 兩種方法基因分型結(jié)果(n=100,n)

2.2福州地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性分析及氯吡格雷代謝類型 324例福州地區(qū)漢族人群中共檢出CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17 4種CYP2C19基因的等位基因，等位基因頻率分別為58.18%(377例)、37.65%(244例)、3.24%(21例)、0.93%(6例)；共檢出CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*1/*17、CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*17和CYP2C19*3/*17 8種CYP2C19基因的基因型，基因型頻率分別為34.26%(111例)、43.52%(141例)、3.09%(10例)、1.23%(4例)、14.20%(46例)、3.09%(10例)、0.31%(1例)、0.31%(1例)，未發(fā)現(xiàn)CYP2C19*3/*3和*17/*17純合子基因型。根據(jù)CYP2C19基因型分布將福州地區(qū)漢族人群氯吡格雷代謝類型分為強(qiáng)代謝型、中間代謝型和弱代謝型，其比例分別為34.26%、47.84%和17.90%。含有CYP2C19*2等位基因的基因型是構(gòu)成福州地區(qū)漢族人群氯吡格雷弱代謝型的主要類型。

2.3CYP2C19基因分型結(jié)果驗(yàn)證 采用熒光PCR毛細(xì)管電泳法對所獲得的8種CYP2C19基因型進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證，其基因分型的電泳圖譜見圖1。

注：A為基因型CYP2C19*1/*1；B為基因型CYP2C19*1/*2；C為基因型CYP2C19*1/*3； D為基因型CYP2C19*1/*17；E為基因型CYP2C19*2/*2；F為基因型CYP2C19*2/*3；G為基因型CYP2C19*2/*17；H為基因型CYP2C19*3/*17；橫坐標(biāo)中標(biāo)記CYP2C19_2/_3/_17分別代表突變型*2/*3/*17；WT代表野生型基因片段；縱坐標(biāo)數(shù)值代表相對熒光單位(RFU)。圖1 熒光PCR毛細(xì)管電泳法基因分型電泳圖譜

3 討 論

CYP2C19在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化與藥物代謝中具有重要作用，參與多種藥物代謝。有研究報(bào)道，氯吡格雷等藥物的代謝速率與有效藥量的個(gè)體差異和CYP2C19的基因多態(tài)性有關(guān)，CYP2C19基因多態(tài)性是影響臨床上冠心病藥物治療及經(jīng)皮冠狀動脈介入手術(shù)后出現(xiàn)不良反應(yīng)的重要原因[3-4]。CYP2C19基因座位于染色體10q24.2上，由9個(gè)外顯子構(gòu)成，CYP2C19基因野生型為CYP2C19*1/*1。在亞洲人群中CYP2C19基因的SNP位點(diǎn)常見突變有CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17[5]，國內(nèi)學(xué)者對不同地區(qū)、不同種族群體的CYP2C19基因多態(tài)性進(jìn)行了大量研究，表明在中國人群中CYP2C19基因多態(tài)性存在地域和種族之間的差異[6]。本研究發(fā)現(xiàn)福州地區(qū)漢族人群中CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*1/*17、CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*17和CYP2C19*3/*17 8種基因型頻率分別為34.26%、43.52%、3.09%、1.23%、14.20%、3.09%、0.31%和0.31%，根據(jù)CYP2C19基因型與氯吡格雷代謝類型的對應(yīng)關(guān)系，可以將福州地區(qū)漢族人群的氯吡格雷代謝類型分為強(qiáng)代謝型、中間代謝型與弱代謝型，其比例分別為34.26%、47.84%、17.90%，表明福州地區(qū)漢族人群以氯吡格雷中間代謝型為主，其弱代謝型比例與國內(nèi)報(bào)道的廣東、江浙及云南等其他地區(qū)人群無明顯差異[7-10]。

目前CYP2C19基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是DNA測序法，能夠準(zhǔn)確反映CYP2C19基因各等位基因的突變情況，但由于測序法對儀器與實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較高、成本較高，多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室難以開展DNA測序進(jìn)行CYP2C19基因檢測，尤其是測序法存在耗時(shí)久、操作復(fù)雜等問題，難以滿足臨床CYP2C19基因快速檢測的需求[8]。國內(nèi)外也存在微電子DNA陣列法、PCR熔解曲線法等方法檢測CYP2C19基因多態(tài)性的報(bào)道[11-14]，但上述方法也存在反應(yīng)步驟煩瑣，易發(fā)生污染等問題。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與熒光PCR毛細(xì)管電泳法兩種方法進(jìn)行CYP2C19基因檢測，以100例福州地區(qū)漢族人群為研究對象，比較檢測結(jié)果的差異，研究結(jié)果表明熒光定量PCR法與熒光PCR毛細(xì)管電泳法在CYP2C19基因多態(tài)性檢測方面具有良好一致性，均能夠用于臨床CYP2C19基因快速檢測，對臨床CYP2C19基因檢測方法的選擇具有參考價(jià)值。熒光PCR毛細(xì)管電泳法較實(shí)時(shí)熒光定量PCR法具有復(fù)合擴(kuò)增、高通量檢測及結(jié)果判讀簡單直觀等優(yōu)點(diǎn)，尤其采用抗凝全血標(biāo)本免提取直接PCR擴(kuò)增的方式，減少了提取及純化基因組DNA的環(huán)節(jié)，大大縮短了檢測時(shí)間及避免了提取過程中的標(biāo)本間交叉污染，不僅可以滿足臨床檢測需要，而且更適合大規(guī)模的基因篩查。