耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥表型檢測的研究

黃小華,施 瑜

重慶市云陽縣中醫院檢驗科,重慶 404500

肺炎克雷伯菌(KP)是一種革蘭陰性菌，廣泛存在于自然環境中，在臨床中屬于常見的條件致病菌，感染KP時可引起血流感染、尿路感染、肺炎等[1-2]。近年來，碳青霉烯類抗菌藥物被廣泛應用于臨床，由于不合理使用抗菌藥物的情況較多，導致KP對碳青霉烯類藥物的耐藥性逐漸增加[3]。當感染KP時，患者體內的菌株清除難度較大，這不僅會延長患者的住院治療時間，還會給其生命安全構成極大威脅。因此，為了有效治療KP感染，治療前必須深入分析患者感染KP的耐藥性，以合理選擇抗菌藥物。本研究為了進一步了解耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)耐藥表型檢測的價值，對2018-2021年本院分離的450株KP進行了臨床分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 對2018—2021年本院分離的450株KP進行分析，以同一患者相同細菌保留檢出的第1株為原則剔除重復菌株。收集記錄KP菌株對應的標本類型、標本收集日期，以及患者的性別、年齡、臨床科室、出入院日期。

1.2方法

1.2.1細菌鑒定 采用MicroScan WalkAway 96全自動微生物鑒定儀對450株細菌進行細菌種屬鑒定。

1.2.2KP耐藥表型確證 采用改良Hodge試驗行產碳青霉烯酶表型確證，將大腸埃希菌ATCC25922標準菌株配制成0.5麥氏單位的菌懸液，隨后采用生理鹽水按1∶10將0.5麥氏單位的菌懸液稀釋，稀釋后涂于MH瓊脂平板上，于平板中間貼上相應的藥敏試紙。分別挑取血平板上過夜培養的陽性質控菌株、陰性質控菌株和待檢菌株，數量均為3～5個，在平板邊緣向中心劃線并接種，于35 ℃環境下培養20 h，若菌線周圍細菌呈矢狀生長，則證實該菌株產碳青霉烯酶。

1.2.3產超廣譜β內酰胺酶確證試驗 將KP用生理鹽水配制成0.5麥氏單位的菌懸液，抽取適量菌懸液涂于MH瓊脂平板，采用頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸藥敏試紙進行檢測，于35 ℃環境下培養20 h，任意藥敏試紙和復合藥敏試紙的抑菌直徑差距≥5 mm，則表示該菌產超廣譜β內酰胺酶。

1.2.4AmpC酶檢測 采用紙片擴散(K-B)法，將頭孢西丁耐藥(抑菌圈直徑≤17 mm)、頭孢噻肟耐藥(抑菌圈直徑≤22 mm)定為疑似產AmpC酶，隨后進行改良三維試驗。首先，抽取過夜培養的純分離菌落，并接種至5 mL的滅菌肉湯(LB)培養基中，于35 ℃孵育箱內培養4 h，培養后以2 000 r/min的轉速對標本進行20 min離心處理，留取上清液，沉淀后放入—20 ℃冰箱中反復凍融8次，再次以12 000 r/min的轉速離心20 min，獲取的上清液則為酶粗提取物。將0.5麥氏單位的大腸埃希菌ATCC25922接種于MH瓊脂平板上，將FOX紙片貼于平板中間，采用滅菌刀片從紙片邊緣5 mm處向外切寬為1 mm的夾縫，抽取40 μL細菌酶粗提取物并加入夾縫中，于35 ℃孵育箱內培養24 h。若該菌株沿夾縫呈箭頭樣向內生長，則表示該菌產AmpC酶。

1.2.5藥敏試驗 主要選取替加環素、美羅培南、亞胺培南等抗菌藥物進行試驗，根據美國臨床和實驗室標準化協會相關標準確定藥物的敏感、中介、耐藥。

1.2.6多位點序列分型(MLST)檢測 MLST 根據Institute Pasteur MLST and Whole Genome MLST Database(http：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/)分型標準進行，采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增KP 7個管家基因(rpoB、phoE、gapA、infB、mdh、tonB和pgi)。擴增產物送至廣州華大基因公司測序，基因序列上傳至Institute Pasteur MLST and Whole Genome MLST Database，獲得相應的等位基因編號，進而檢索出菌株的序列分型(ST)。

1.3觀察指標 (1)觀察450株KP的標本來源類型；(2)觀察450株KP中CRKP與碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌(CSKP)對臨床常用抗菌藥物耐藥的情況；(3)觀察CRKP主要耐藥表型對臨床常用抗菌藥物的耐藥情況；(4)觀察主要耐藥表型CRKP來源患者的性別、年齡、住院時間、標本類型、臨床科室分布情況。

1.4統計學處理 采用世界衛生組織(WHO)細菌耐藥性監測網提供的WHONET5.6軟件進行細菌耐藥數據統計，采用SPSS22.0統計軟件對數據進行統計學處理，藥敏結果及耐藥表型分布情況采用χ2檢驗進行比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1KP的標本來源 450株KP主要來自痰液(45.6%)、分泌物(17.6%)、尿液(15.1%)、血液(8.4%)標本。見表1。

表1 KP的標本來源

2.2KP的耐藥檢測結果 450株KP對亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率分別為6.00%、6.00%、7.78%；其中CRKP共36株，占8.00%，產超廣譜β內酰胺酶菌株共83株，占18.4%，產AmpC酶菌株共29株，占6.4%。CRKP對替加環素、阿米卡星等23種抗菌藥物的耐藥率均高于CSKP菌株，差異有統計學意義(P<0.001)。見表2。

2.3CRKP耐藥表型 MLST檢測結果顯示，36株 CRKP中有11株為ST11型，占30.56%；7株為ST2305型，占19.44%；5株為ST2390型，占13.89%；2株為ST736型，2株為ST20型，而ST23型、ST25型、ST34型、ST147型、ST441型、ST629型、ST1224型、ST2236型、ST2389型各1株。

2.3.1不同耐藥表型CRKP對臨床常用抗菌藥物的耐藥情況 常見的ST11型、ST2305型、ST2390型菌株對替加環素的耐藥率較低，但對臨床其他常用抗菌藥物的耐藥率均較高，3種常見耐藥表型CRKP菌株的耐藥率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.3.2不同耐藥表型CRKP的分布情況 常見的ST11型、ST2305型、ST2390型菌株來源患者性別比例較一致，以≥15歲人群為主，住院時間多≥31 d，痰液、分泌物標本培養出來居多，主要分布于ICU、肺病科、老年病科，此3種耐藥表型CRKP在各項分布上比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。而其他型CRKP在性別上的比例也較一致，以老年人(≥65歲人群)為主，住院時間多≥31 d，痰液標本培養出來居多，主要分布于ICU、老年病科。見表4。

表4 不同耐藥表型CRKP的分布情況[n(%)]

3 討 論

目前，細菌耐藥已成為全球公共衛生問題，及時發現、監控醫院CRKP的定植感染對控制細菌耐藥、細菌傳播、保護患者生命安全具有重要意義。KP是腸桿菌科克雷伯菌屬中最為重要的一類菌，呈桿狀，多以單獨、成雙或短鏈狀排列，有較厚的莢膜，多數有菌毛，無芽孢，無鞭毛，其所致疾病占克雷伯菌屬感染的90%以上[4]。KP主要分布于人體上呼吸道和腸道，當人體免疫力下降時，該細菌會經由呼吸道入侵肺部，引起感染。在醫院對標本進行細菌鑒定時，KP較為常見。本研究結果表明，本院分離的450株KP主要來自痰液(45.6%)、分泌物(17.6%)、尿液(15.1%)、血液(8.4%)。凌峰等[5]研究同樣發現KP主要來源于痰液標本(73.91%)。然而，對于感染KP的患者，臨床必須為其合理選擇抗菌藥物，以提高細菌清除率，改善患者預后。

在所有非典型β-內酰胺類抗菌藥物中，碳青霉烯類藥物的抗菌譜最廣，抗菌活性最強，且毒性低，該類藥物在細菌感染治療中發揮著重要作用[6-7]。近年來，隨著碳青霉烯類藥物的應用越來越廣泛，細菌耐碳青霉烯類藥物的問題也日益突顯。碳青霉烯酶一般分為A、B、D 3種類型，其中A類為絲氨酸酶，B類為金屬β-內酰胺酶，D類為苯唑西林酶[8-9]。為了了解細菌耐碳青霉烯類抗菌藥物的情況，諸多學者開展了相關研究探索。楊燕文等[10]研究指出，29株KP中共有20株(占68.97%)檢測到碳青霉烯酶基因，其中KPC檢出率為17.24%(5/29)，IMP檢出率為13.79%(4/29)，NDM檢出率為37.93%(11/29)，該研究認為KPC-2、NDM-1是碳青霉烯酶的主要耐藥基因型。在本研究中，450株KP對亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率分別為6.00%、6.00%、7.78%。該結果提示，KP對碳青霉烯類藥物有一定耐藥性，但對美羅培南、亞胺培南、厄他培南等藥物的耐藥性相對較低，這一結果與徐婭雯等[11]研究結果相似。然而，值得注意的是碳青霉烯酶中的金屬酶水解活性相對較弱，進行導致藥敏試驗時碳青霉烯類抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)可出現升高情況，但仍然未達到耐藥折點，甚至可表現為敏感[12-13]，這也導致耐藥基因出現傳播且未被注意到。不過本研究結果顯示，CRKP對復方磺胺甲噁唑和呋喃妥因的耐藥率分別為61.11%、66.67%，對替加環素的耐藥率僅為13.89%，這提示四環素類、硝基呋喃類及磺胺類等抗菌藥物可作為治療CRKP感染的選擇藥物。因此，在治療早期，醫師可以選擇CRKP敏感的藥物進行抗感染治療，尤其是替加環素，之后可以根據細菌藥敏鑒定結果，進一步選擇敏感、安全的抗菌藥物。

一直以來臨床認為碳青霉烯類藥物是治療產超廣譜β-內酰胺酶KP感染的有效抗菌藥物，但是超廣譜-β內酰胺酶、AmpC酶的產生與膜孔蛋白改變等耐藥機制合并出現時，會進一步增加KP的MIC值，此時KP則對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，極易導致感染的暴發流行。本研究結果也顯示，36株CRKP菌株中，產超廣譜-β內酰胺酶菌株及產AmpC酶菌株比例非常高。因此，對本地區CRKP感染的流行病學特征進行探討尤為重要。本研究中耐藥表型分析顯示，36株 CRKP中有11株ST11型(30.56%)、7株ST2305型(19.44%)、5株為ST2390型(13.89%)，其他多種表型菌株占比小。本研究結果還顯示，3種優勢菌株對替加環素的耐藥率較低，但對喹諾酮類、磺胺類、氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥率均在50%以上。經對比發現這3年以來，出現了少量新的ST型菌株。因此，臨床上在監測主要優勢菌株流行的同時，也要關注一些散發的ST型。36株CRKP主要來源于≥15歲人群，住院時間較長，痰液標本培養出來居多，主要分布于ICU、肺病科、老年病科。ICU、老年病科收治的患者病情較嚴重，且患者年齡大，基礎疾病多，機體免疫力低下，大多數患者接受過侵入性操作，醫院獲得性感染的發生率更高，感染CRKP后，又會導致住院時間明顯延長。呼吸道傳播是CRKP最常見的傳播途徑，而肺病科收治的患者以呼吸系統疾病為主，患者更易發生醫院獲得性呼吸道感染。同時，ICU、老年病科、肺病科的患者抗菌藥物使用較多，且住院時間相對較長，這也是同源性KP分布較多的原因。雖然目前CRKP同源性分析沒有一個明確的標準，但從各耐藥表型的比例可看出，本院CRKP菌株的同源性相對值比較低，證實臨床科室針對CRKP感染做好了手衛生、環境消毒等工作，避免了CRKP進一步的播散流行，真正做到了早發現，早隔離，早治療。同時，本院院感科重視CRKP的檢出，認真查對檢出CRKP的臨床科室、患者資料及標本送檢情況，并對臨床科室進行環境物體表面采樣，積極尋找傳染源。實驗室也能及時和臨床科室溝通，對合格標本進行培養，提高了CRKP菌株的檢出率。

綜上所述，耐藥表型檢測能較好地反映本院CRKP局部流行的態勢，也能了解菌株發生變異的情況，如結合常規藥敏試驗，可有效預防和控制CRKP的播散。