外周血IL-6可能通過促進濾泡輔助性T細胞的分化參與1型糖尿病的發生

牛騰耀，崔振華，高 強，岳曉琪，詹靜慧，張艷麗

寧夏醫科大學基礎醫學院病原生物學與免疫學系，寧夏銀川 750004

1型糖尿病(T1DM)是由T細胞介導的胰島β細胞破壞引起的自身免疫性疾病，嚴重威脅人體健康。T1DM患者因自身免疫及胰島β細胞被損傷，引起胰島素分泌不足，必須長期采用胰島素進行治療，而我國T1DM的發病率為1.01/10 000[1]。定位于淋巴濾泡的濾泡輔助性T(Tfh)細胞是發揮免疫效應的CD4+T細胞亞群，是一種輔助B細胞[2]。研究表明，CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞是與淋巴濾泡中的Tfh細胞功能對應的細胞群體，可分泌白細胞介素(IL)-21，并促使B細胞增殖分化，使體液免疫增強[3-4]。眾所周知IL-6是趨化因子家族成員之一，主要由單核巨噬細胞、血管內皮細胞等生成，其作用靶細胞較多，是一種具有復雜生理功能的細胞因子，與感染性疾病有關，可促進B細胞的增殖分化。IL-21是Tfh細胞活化后分泌的特征性細胞因子，主要存在于生發中的B細胞卵泡中，可以調節B細胞的活性[5]。但IL-6能否作用于Tfh細胞參與自身免疫性疾病的發生尚不清楚，本研究通過分析T1DM患者外周血中CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比與IL-6、IL-21之間的相互關系，嘗試為T1DM的發病機制與診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年10月至2020年10月在寧夏醫科大學總醫院(以下簡稱“本院”)內分泌科住院的30例T1DM患者為研究組。所有患者均符合1999年世界衛生組織(WHO)制定的T1DM診斷標準，以無任何自身免疫性疾病、C肽釋放正常為排除標準。選擇同期在本院體檢的20例健康者作為健康對照組，均無感染性疾病、自身免疫性疾病及糖尿病。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經過本院醫學倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 FC酶標儀購自美國Thermo公司，Accuri C6流式細胞儀購自美國BD公司。使用的主要試劑盒包括Anti-human Percpcy5.5-CD4試劑盒(美國，Biolegend)、Anti-human AF488-CXCR5試劑盒(美國，BD)、Human-IL-6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海，江萊生物技術有限公司)、Human-IL-21 ELISA試劑盒(上海，江萊生物技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1T1DM患者外周血淋巴細胞分離及處理 抽取所有研究對象外周血3 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，磷酸鹽緩沖液(PBS)與全血按照1∶1比例稀釋，采用密度梯度離心法分離周圍淋巴細胞，PBS洗滌，調整細胞數后采用流式細胞術檢測CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比。

1.3.2流式細胞術檢測人CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比 取細胞懸液100 μL于試管中，依次加入抗體Anti-human Percpcy5.5-CD4、Anti-human AF488-CXCR5，4 ℃、振蕩、避光、孵育30 min，洗滌，以300 μL冷PBS重懸，于流式細胞儀上進行檢測。所得數據用配套軟件進行分析，在FSC-SSC圖上選定淋巴細胞群，然后以CD4和SSC設門分析CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比。

1.3.3T1DM患者血清中IL-6、IL-21水平檢測 采用ELISA法檢測血清中IL-6、IL-21水平，嚴格按照Human-IL-6 ELISA試劑盒和Human-IL-21 ELISA試劑盒中的說明書操作。

2 結 果

2.1兩組外周血CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比比較 研究組、健康對照組中CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比分別為(23.8±0.68)%、(14.1±0.46)%，研究組明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2兩組外周血IL-6、IL-21水平比較 研究組、健康對照組IL-6水平分別為(34.45±8.31)、(23.46±5.52)ng/L；研究組、健康對照組IL-21水平分別為(202.0±46.51)、(102.9±32.78)ng/L。研究組IL-6、IL-21水平均明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3T1DM患者CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比與血清IL-6、IL-21水平的相關性 采用Pearson相關分析發現，T1DM患者CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比與外周血血清IL-6、IL-21水平均呈正相關(r=0.449 2、0.572 9，P<0.05)，見圖1。

注：A為IL-21與CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比相關分析；B為IL-6與CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比相關分析。圖1 T1DM 患者血清IL-6、IL-21與CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比的相關分析

3 討 論

T1DM是一種由遺傳易感性和環境危險因素相互作用導致胰島β細胞被破壞，進而造成胰島素分泌不足的自身免疫性疾病[6]。Tfh細胞是位于次級淋巴組織(SLOs)生發中心的可輔助B細胞產生抗體的CD4+T細胞，其特征性膜表面分子主要有程序性細胞死亡蛋白(PD-1)、趨化性細胞因子受體(CXCR5)、誘導共刺激分子(ICOS)等，具有輔助B細胞的功能，可參與生發中心的形成及B細胞發育、活化增殖與功能調節，也可為高親和力抗體的產生提供幫助，是機體適應性免疫的重要組成部分，同時參與多種自身免疫性疾病的發病[7-10]。

在自身抗體產生的過程中，生發中心中的Tfh細胞識別B細胞或B細胞所呈遞的抗原，通過CD40L、ICOS和OX40等共刺激，分子與細胞間產生穩定的相互作用，在這種相互作用中，Tfh細胞與B細胞互相依賴，并分泌IL-21、IL-4、IL-9和IL-10等效應細胞因子，它們可促進生發中心反應并可促使B細胞分化為漿細胞和記憶細胞[11]。

IL-6主要由單核巨噬細胞、血管內皮細胞等生成，其作用靶細胞較多，是一種具有復雜生理功能的細胞因子。IL-6參與了多種生物學過程，如免疫應答、炎性反應，同時，低水平IL-6可促進胰島素的分泌，高水平IL-6則可抑制胰島素分泌，但年齡、種族、病程則對血清IL-6水平無影響[12-14]。IL-21是Tfh 細胞活化后分泌的特征性細胞因子，可誘導 Tfh 細胞分化，促進生發中心的B細胞分化為漿細胞，并產生不同類型的抗體。

在本研究中，研究組CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞占CD4+T細胞百分比、IL-6水平明顯高于健康對照組，且CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞與IL-6水平呈正相關。IL-6有兩條信號通路傳導途徑，一條為IL-6與其受體膜蛋白結合，即與IL-6Rα相結合形成一種復合物；另一條則是IL-6與gp130膜蛋白相結合，使體內對IL-6有反應的細胞數量增加[15]。IL-21通過與生發中心B細胞表面或Tfh細胞自身表達的IL-21受體結合，促進漿細胞分化產生大量抗體，誘導Tfh細胞表達CXCR5并遷移至生發中心，維持T-B細胞動態平衡[16]。血清中IL-4、IL-9與人體的免疫反應具有一定的關系。IL-10也稱為細胞因子合成抑制因子(CSIF)，是一種多效性細胞因子，可以在多種類型細胞中發揮免疫抑制或免疫刺激的作用[17]。結合本研究可推測，T1DM自身免疫的發生原因為體內IL-6大量增多，促使CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞的過量分化，并分泌IL-21，IL-21與CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細胞自身表達受體結合，輔助作用于B細胞的分化；同時，IL-4、IL-9、IL-10的分泌也會增多，其促進生發中心反應并促使B細胞分化為漿細胞和記憶細胞，漿細胞分泌蛋白酪氨酸磷酸酶抗體、谷氨酸脫羧酶抗體、胰島細胞自身抗體、抗胰島β細胞抗體等多種自身抗體，損傷胰島細胞，造成胰島素分泌不足，進而導致T1DM的發生。

綜上所述，IL-6可能促進Tfh細胞的活化并分泌IL-21進而輔助B細胞產生自身抗體參與T1DM的發生。但研究樣本量較小，還需進一步擴大臨床樣本量，并結合動物模型進行更深入的機制研究。