流式細胞儀在環境微生物學實驗教學中的應用與實踐

翟利芳， 展思輝， 王 忠

（南開大學環境科學與工程學院，天津 300350）

0 引 言

流式細胞儀（Flow Cytometer，FCM）是以流式細胞術為理論基礎，將激光技術、半導體技術、流體力學及光電測量技術等綜合于一體的大型精密儀器［1-2］，其可對高速直線流動的細胞或者微生物顆粒進行快速測定與分析，具有檢測速度快、數據采集量大，操作簡單快捷等優點，已被廣泛應用于臨床醫學、細胞學、生物學、微生物學等眾多研究領域［3-7］。其中，在微生物學領域，流式細胞儀可以快速檢測環境中各種細菌、病毒顆粒、特殊細菌、藻細胞及水中微生物活體、群落結構等，這些都是環境微生物學實驗研究的對象［8-9］，因此將流式細胞儀應用到環境微生物學實驗教學中對學生科研素質的培養及教學質量的提升至關重要。課題組將流式細胞技術引入環境微生物學實驗教學過程對環境微生物進行測定，使學生利用現代儀器分析技術探究解決環境污染問題的有效途徑，極大激發學生對環保綜合探究性實驗的興趣。

1 流式細胞儀工作原理與特點

1.1 工作原理

流式細胞儀是用以測量在高能量激光照射高速流動狀態下被熒光色素染色或自帶熒光特性的細胞或顆粒產生的散射光和發射熒光的強度，從而對細胞或顆粒的物理、生理、免疫、分子生物學形狀及功能狀態進行定性或定量檢測的一種現代分析儀器［10］。分析型流式細胞儀主要由液流系統、激光光源及光學系統、信號檢測數據獲取分析及電子系統共3 個部分組成。

將待測單細胞懸液經不同熒光物質染色，通過液壓系統送入流動室，細胞在鞘液的包裹下形成單行排列的細胞流，以一定流速經過激光聚焦區。在激光束的照射下，細胞或顆粒產生特定的散射光和熒光信號，激發產生的信號通過波長選擇性濾光片后，經熒光探測器接收并轉化為電信號，最終通過模/數轉換器轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機通過相應的軟件對采集的數字信號進行分析處理，輸出散點、密度或等高線圖及數據表格等形式［11］。基本工作原理如圖1 所示。

圖1 基本工作原理

1.2 儀器特點

教學中心所配備流式細胞儀型號為Accuri C6 Plus，該儀器配有488 nm、640 nm 兩個激光器；4 個光電倍增管（PMT）檢測器，檢測器呈X 環抱型設計；根據流動動力學聚焦原理實現5 ～40 μm 液流寬度可調，負壓上樣。該儀器日常使用的應用范圍非常廣泛，遍布免疫學和細胞生物學以及癌癥研究、水生物研究、生物工藝等，具有以下功能和特點：

（1）創新的直觀軟件操作系統CFlow，可自動進行數據獲取及圈門等數據分析。

（2）跨越7 個數量級的超寬動態范圍，無需調節檢測器電壓。

（3）配備BD CSampler Plus 自動進樣器提供可靠、易用自動化操作，支持48 孔板、96 孔板以及標準φ12 mm×75 mm管的24 管架。

1.3 上機培訓

實驗教學中將環境微生物學實驗教學內容與流式細胞儀應用結合起來，從流式細胞儀對環境水樣中死/活細菌進行鑒別并計數、微生物的分離與鑒定、微生物生長的測定、微生物生化特征測定等方面的應用進行講解。主要包括4 個方面的內容：

（1）結合實際儀器構造講解流式細胞儀的組成，由液流、光學及電學系統3 個部分組成。

（2）逐一開啟穩壓電源、儀器開關及計算機開關進入開機程序，強調開/關機之前、過程中及儀器日常維護的注意事項。

（3）運行CFlow軟件，講解軟件界面組成、樣品檢測參數設置及常用術語、熒光補償原理及調節、檢測數據結果圖示及表格分析。

（4）以細胞計數實驗為例，藻/菌實驗樣品上機演示流式細胞儀在環境微生物檢測中應用檢測方法。

通過上機培訓環節，學生在掌握流式細胞儀基本原理的基礎上加深對儀器構造的認識，熟練掌握儀器使用方法，為后續實驗操作環節奠定基礎。

2 抗生素對銅綠微囊藻生長影響的測定

環境微生物學以微生物學的理論與技術為基礎，研究有關環境現象、環境質量及環境問題，實驗對象涉及環境中各種菌、藻等微生物，皆可應用流式細胞儀進行檢測［12-13］。課題組設計了“抗生素對銅綠微囊藻生長的影響測定實驗”，利用流式細胞儀測定某種抗生素進入水體對藻類生物量的變化影響。通過流式細胞儀和血球計數板對經過染毒處理的微藻進行計數，評價某種抗生素對藻類生長影響，同時驗證流式細胞儀是否能夠比血球計數板更加準確地對水體中微藻進行計數。

2.1 實驗原理

近年來，因抗生素的濫用所造成的污染已經成為主要環境問題之一，引發的生態安全和健康問題引起人們的普遍關注。藻類是最簡單的光合營養有機體，是水生生態系統的初級生產者。在一定環境條件下，如果某種有毒有害化學物質及其復合污染物進入水體，藻類的生命活動就會受到影響，生物量就會發生改變。通過測定藻類數量的變化，就可以評價抗生素對藻類生長的影響及對整個水生生態系統的綜合環境效應。

銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa），屬于藍藻細菌，在環境中占據重要的生態位置，是水華爆發的主要藻類之一，故將其作為探究抗生素對環境中藻類影響的實驗藻種。以培養一定時間的銅綠微囊藻為對照，在完全相同培養條件下，加入一定濃度的抗生素污染物后，定時、定點取樣，直接測定水中藻濃度的變化。

2.2 實驗儀器與試劑

實驗儀器：電子天平、pH 計、光照培養箱、高速冷凍離心機、血球計數板、流式細胞儀、紫外可見分光光度計、滅菌鍋、單人凈化工作臺、光學顯微鏡等。

實驗試劑：四環素、NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·H2O等配置培養基所需試劑等。

2.3 實驗步驟

（1）培養液的配制。將儲存母液混合、稀釋，按照BG11培養基［14］進行配置，按一定體積分裝在各個三角瓶中經121 ℃高壓滅菌20 min。吸取一定體積母液加到滅菌后的培養液中，搖勻，使成所需濃度。

（2）藻種預培養。將所得銅綠微囊藻藻種移至盛有培養基的三角瓶中，在實驗所設溫度和光強下，通氣或在三角瓶內保留足夠空間培養，隔96 h 移種1 次，反復2 ～3 次，使藻種生長達到同步生長階段，以此作為實驗藻種。

（3）接種培養。將達到同步生長的藻種培養液充分搖勻，吸取一定體積加至各組培養液中。一般初始藻種濃度可采用（1 ～5）×106個/mL，接種量控制在10% ～20%。

（4）實驗濃度的選擇。根據四環素對銅綠微囊藻生長影響的半數有效濃度（EC50）范圍［15-16］，設定對銅綠微囊藻96 h的EC50約為10 mg/L。設計藻液中抗生素濃度梯度為0、0.1、0.5、1、2、5、10、20 mg/L，各濃度組均設3 個平行樣。

（5）培養條件。在（24 ±2）℃，白色熒光燈光照下培養，光強（2 000 ±200）lx。三角瓶可放置搖床上震蕩（110 次/min）以便空氣交換。光暗比為12 h ∶12 h。

（6）生長測定。在藻類毒性實驗中，應定時取樣測定藻類的生長情況，一般為24 h取樣一次。在96 h取樣測定污染物對藻類生長影響的EC50值，即與對照組相比，生長率下降50%的污染物濃度。

2.4 測試方法

本實驗采用血球計數板和流式細胞儀兩種測定方法對實驗中銅綠微囊藻的數量進行計數，進而判斷四環素對銅綠微囊藻生長的影響。

（1）血球計數板計數。取1 mL的微藻懸液于離心管中，加4%的戊二醛160 μL，靜置5 min；試驗采用25 ×16 格的血球計數板在顯微鏡下記錄右上、右下、左下、左上、中間5 個中號方塊中的微藻細胞數目。

（2）流式細胞儀計數。取0.5～1mL濃度在5×105～1×107個范圍內的藻液，經300目篩網過濾置于流式上樣管中；將上樣管置于流式細胞儀進樣針位置，設置參數：閾值設置80 000 on FSC-H，上樣時間30 s，高速進樣；檢測。每一次進樣速度重復3 次。

3 實驗結果分析

3.1 兩種測試方法結果對比

用血球計數板和流式細胞儀分別對同一濃度的微藻藻液進行計數，觀察它們的平均值和相對標準偏差（見圖2）。兩種方法測定3 種不同濃度的微藻數量在平均值上相差不多，但從RSD（相對標準偏差）來看，血球計數板的RSD都在5%以上，樣品2 的測定結果RSD值高達9.8%。由此，可以看出采用血球計數板的方法易受操作細節及操作者主觀因素影響，精確性得不到保證，并且費時費力，不適用于大規模的細胞實驗；而流式細胞儀對不同濃度的微藻藻液RSD 都在2%以內。由此可見，流式細胞儀比血球計數板的精確度高。

圖2 兩種測定方法精確度比較

3.2 四環素對微藻生長的影響

圖3所示為采用流式細胞儀分析技術測定的四環素對銅綠微囊藻生長抑制情況。由圖可見，隨著染毒時間的增加，四環素對銅綠微囊藻的抑制作用相應增加，當四環素濃度較高時這種趨勢更為明顯。低濃度處理（0.1 ～2 mg/L）時，四環素類抗生素對銅綠微囊藻生長影響很小，而高濃度處理（5 ～20 mg/L）時，其對銅綠微囊藻產生明顯的抑制作用。四環素濃度為20 mg/L，接觸時間為96 h時，其對銅綠微囊藻的最大抑制率達到了68.35%。由此可見，四環素對銅綠微囊藻的毒性濃度效應非常明顯。

圖3 四環素對銅綠微囊藻生長抑制率的影響

4 結 語

流式細胞術作為一種新興儀器分析技術，在水環境微生物測定方面還處于發展階段，在環境微生物學實驗教學中引入該檢測技術是一次新的嘗試。流式細胞術的引入豐富了環境微生物學實驗教學內容及方法，拓展學生實驗設計思維，不僅調動學生的學習熱情，而且大大提高了大型貴重儀器的利用率。流式細胞術在環境微生物學實驗教學中的應用，實現了科研與教學的有機融合，使學生的探索與實踐能力得到顯著提升，使學生在很好掌握流式細胞術的基礎上可將其應用到今后的科學研究中。