水生動物病害數字化標本庫的建設及其在水生動物醫學專業上的應用探討

謝 妙， 龐歡瑛， 周銀環， 李長玲， 師尚麗

（廣東海洋大學水產學院實驗教學中心，廣東 湛江 524088）

0 引 言

水生動物醫學是一門研究水生動物病原、病理、疾病防控與治療等方面的學科，是水產學科的重要組成部分。水生動物醫學主要研究水產動物疾病的發生以及發展規律、病原的致病機制、病害的預防與治療，以期為水產養殖病害提供診斷和治療的理論基礎和實踐依據。水生動物病害生物標本是水生動物醫學實驗教學的重要道具，以直觀、生動、全面展示方式為學生提供水產動物病害相關的臨床特征、發展規律等學習資料，有助于加深學生對水生動物病害的理解和認知。但由于傳統水生動物病害標本庫的建設存在種種不足，比如標本來源途徑有限、標本制作不規范、標本病害不典型、標本病原鑒定不明確、標本保存不當損壞等問題，直接影響實驗教學的生動性和趣味性以及后續的學習過程［1］，從而影響實驗教學的效果。本文將通過對我校水產學院實驗教學中心現有的水生動物病害標本庫存在的問題進行分析，然后在擴充標本庫來源、建立水產動物病害標本制作和分類鑒定的標準、建立水生動物病害標本數字化標本庫給出建議，并對數字化標本庫在未來實驗教學上應用進行探討，以期為水生動物病害標本庫的改造、數字化標本庫的建設及其在教學上的應用提供參考。

1 我校水生動物病害生物標本庫現有問題分析

1.1 標本庫的現狀

標本庫的建設需要有專業的管理隊伍和相應的管理規章制度，并需要長期的投入來完善標本庫資源。本院水生動物病害標本庫建立時間較早，在長期的投入和管理后已具有一定的規模。現有的標本庫中水生動物病害標本從標本制作上可以分為浸制標本、玻片標本、整裝制片標本，其中浸制標本數量最多；從標本物種來源來分又可以分為有病魚類標本、有病甲殼類標本、有病貝類標本、寄生蟲標本、病原微生物標本等。

標本庫建設已久，現在存在的問題主要有：（1）標本種類和數量有限，由于病害標本主要來源于學生實習采樣，病原宿主種類局限于幾種常見的經濟水產動物，標本的種類和數量尚需進一步擴充；（2）標本制作不規范，不同的水生動物標本的預處理方法和保存液的配方是不同的，而在學生采樣時往往會對不同的物種來源的標本采用相同的制作方法，導致標本制作不規范；（3）病害標本不典型，病原鑒定不明確，由于水產動物疾病流行特點和區域養殖結構的差異，典型病害標本的來源有限，標本收集困難，再加上管理上的問題，導致部分標本的病害的病原鑒定也不明確，影響實驗教學結果；（4）標本保存不當，有些標本制作年代久遠，在保存過程中有可能會因為標本庫環境變化、管理不到位導致標本損壞、變形、腐爛、丟失；（5）缺乏專業的管理人員和相應的管理規章制度，導致標本庫的建設仍處于比較初級的探索階段。

1.2 標本在實驗教學應用中遇到的問題

水生動物病害標本是水生動物醫學實驗課重要的教學道具，也是學生直觀了解病原體和病變組織形態特征的重要學習材料。但由于實體標本自身的局限性，在應用到實驗教學實踐中遇到的問題有：①展示模式單一。受限于標本自身的局限性，學生對標本的觀察停留在病理切片的“二維觀察”和大型標本有限視角的“三維觀察”上，部分寄生蟲和藻類標本體積小不易觀察，加之長期浸泡的標本褪色、變形影響觀察結果，導致實驗教學結果不佳；②學習途徑有限。標本庫僅在實驗教學期間開放，相較于互聯網資源的可隨時隨地查閱調取、全天候開放的優點，標本庫提供的學習途徑顯得模式單一而有限，不利于課外學習的擴展，再加上標本庫中空氣甲醛濃度高，不利于身體健康，學生在標本庫學習的時間也相對短暫，多數停留在走馬觀花的學習形式；③與生產實踐關聯度不夠。水生動物病害標本比較直觀的展示了病害的臨床特征和發展規律，有助于病原的鑒定和病害的診斷的學習，但不能提供與生產實踐關聯度更高的病害防控、治療的信息。如若利用互聯網的優勢，在病害標本的資料庫中擴充經典病害防控、治療案例，以文字、圖片、視頻等多媒體的形式展示，將理論學習與生產實踐更緊密的聯系起來，可加深學生對水生動物病害防控的認知和理解，加強標本庫建設與生產實踐的聯系。

2 實體標本庫建設的改造

2.1 擴充水生動物病害標本庫資源來源

水生動物病害標本庫的資源主要來源于學生去野外或水產養殖公司實習時的采集，少數來源于教師社會服務采集。由于水產養殖病害季節性流行特點和養殖動物區域結構的差異性，采集到的標本物種局限于幾種常見的養殖品種，采集地點也局限在近距離地區，標本庫資源的種類和數量收到了很大的限制。為了解決這個問題，將采取以下措施來擴充水生動物病害標本的來源：①加強與水產企業的合作，如水產養殖企業和漁業藥物服務公司，鼓勵學生去一線生產實踐中學習，從而能收集到更多的標本；②鼓勵科研工作者參加更多社會服務，建立與養殖戶良好的合作關系，不定期收集養殖戶送檢的水生動物病害樣本；③在水生動物病害流行爆發的季節，組織師生去水產動物病害流行地采集標本或購買具有典型病理特征的標本；④加強與高校同行合作，共享數字化標本庫的資源。

2.2 規范化水生動物病害標本的制作

水生動物病害標本通常使用浸制法制作，使用甲醛溶液和酒精溶液作為標本固定保持液，但對于不同物種的標本保存法也有所不同。

（1）有病魚類標本。用于制作標本的魚首先要進行去污和除黏液的預處理，再從胸鰭基部或腹鰭基部進行腹腔注射10%的福爾馬林溶液，然后將標本放入5% ～10%的福爾馬林溶液中進行固定，固定時間根據個體大小調整，待魚體僵直后再轉入5%的福爾馬林溶液中長期保存［2］。

（2）有病甲殼類標本。甲殼類的動物首先要進行麻醉或殺死處理，可采用氯仿或乙醚麻醉，或采用窒息法殺死，避免直接浸泡固定液時出現附肢自切的現象［3］。固定后的甲殼類動物可放在15%的福爾馬林與10%的甘油混合液里長期保存［4］。

（3）有病貝類標本。貝類標本可先用硫酸鎂或多聚乙醛等藥品進行麻醉處理，頭足類的動物如烏賊、章魚可用淡水麻醉，麻醉后的動物可以用70% ～75%的乙醇溶液進行固定和長期保存［3］。

（4）寄生蟲標本。對于體積較大的寄生蟲，如線蟲、魚怪等，可以經解剖和宿主分離，并用棉線固定在玻璃載片上與宿主存放在同一玻璃容器中，用10%的福爾馬林溶液固定并長期保存；體積較小的寄生蟲則單獨分離出來在小體積的玻璃容器中用10%的福爾馬林溶液固定并長期保存。

（5）微生物標本。引起水生養殖動物病害最主要的微生物病原體有弧菌、無乳鏈球菌、嗜水氣單胞菌等細菌類病原體，水霉、鐮刀霉菌為主的真菌類病原體，白斑病毒、虹彩病毒、神經壞死病毒等病毒類病原體，車輪蟲、小瓜蟲、瓣體蟲等原蟲類的病原體以及少數藻類病原體。細菌類、真菌類、原蟲類、藻類的病原體可先進行對應的方法進行固定、染色、脫水后再用中性樹脂進行封片長期保存［5］，病毒類的標本則提取核酸后擴增再-70 ℃下長期保存，或者制作DNA 條形碼。此外，魚類標本、甲殼類標本、貝類標本和較大的寄生蟲標本應在制作之前進行拍照，尤其是病灶部分應進行微距拍照特寫，避免長期浸泡或保存不當導致標本褪色、病灶部位變形。對于不易肉眼觀察的較小的寄生蟲、原蟲類、藻類等病原體可以固定后制成臨時水封片，在顯微鏡下拍照，然后再進行后續的處理制成長期保存的標本。

（6）病理切片標本。選具有典型病害代表的新鮮個體作為病理切片制作的對象，根據用途選取合適的體積和厚度的組織，按照各病變部位、性質的不同規范取材，再經過固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片貼片、染色和封片后制成高質量的病理切片標本［6-7］。

2.3 規范標本鑒定與分類

標本制作完成后，由專業的形態學分類專家對病害標本進行鑒定分類。病害標本按照病原宿主和對應的病原體按照各自的門、綱、目、科、屬、種進行分類鑒定，鑒定結果盡可能分類至屬、種級別［8］，對于難以鑒定的微生物標本可以提取核酸以后通過聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增，產物經電泳和基因測序后獲得DNA 條形碼信息以便鑒定。鑒定完畢須對浸制標本、玻片標本貼標簽處理，標簽信息應詳盡包括：標本編號、疾病名稱、宿主和對應的病原體名稱、拉丁文名稱、采集地點、采集日期、保存介質、鑒定人員［9］，有DNA條形碼的標本還應增加相應的二維碼標識。標本制作完成后，建立電子檔案，記錄標本的圖片和標簽信息，保證標本的圖片和實體、標簽信息一一對應。

2.4 改善標本庫環境和完善管理制度

標本庫保存環境要求較低的溫度和濕度，溫度要求控制在15 ～20 ℃為宜，濕度要求控制在40% ～50%為佳［10］，避免太陽直射，可通過安裝空調和除濕機來滿足標本庫對溫濕度的環境要求。由于標本固定液通常為具有揮發性的乙醇和甲醛溶液，標本庫建設還需要安裝通風設備和消防設施。標本固定液在長期保存中會揮發或變質，標簽也可能老化脫落，因此需要定期對標本保存的情況進行檢查，對于變色變質的保存液需要更換或補充，脫落的標簽需及時重新貼上，檢查以半年1 次為佳。

完善標本庫的管理制度主要從4 方面做起：①加強標本庫的管理隊伍的建設，包括設立專職管理人員、鑒定人員；②完善標本庫的出入庫管理，做到標本出入有記錄可查，降低標本丟失、破損的幾率；③完善標本庫保存管理制度，規范標本的保存和檢查方法；④規范化標本的采集、制作、鑒定、分類、來源擴充的標準。

3 數字化標本庫的建設

已有不少高校和研究機構建立了數字標本庫，包括人體寄生蟲數字標本庫［11-12］、獸醫病理數字標本庫［1］、植物病害電子標本庫［13］等數字標本庫，在理論教學和實驗教學上發揮了重要的作用，但有關水生動物病害數字標本庫的建立還是鮮見于報道。建立水生動物病害數字標本庫，不僅有利于標本的長期保存、節約資源和保護環境，還能改善水生動物醫學的實驗教學效果，為了滿足學科專業建設的需求，建立數字標本庫勢在必行。建造水生動物病害數字標本庫的步驟如圖1 所示。

3.1 標本的篩選

圖1 水生動物病害數字化標本庫建造流程

制作數字標本庫之前應對標本進行篩選，用于制作數字標本庫的標本應滿足這些條件：①病害標本必須是能代表該病害的典型標本，具有該病害最典型的臨床特征，能比較直觀地展示該病害的發展規律；②病害標本應是近期制作或保存完好的標本，沒有褪色、病灶模糊、變形的瑕疵；③病害標本應是經過明確的鑒定分類的標本，宿主和病原體的物種鑒定明確，相關存檔信息詳盡完整；④病理切片標本以及病原微生物封片標本應是制作精良、染色良好、代表典型、保存完好的標本。

3.2 標本圖像采集和處理

建立數字標本庫需要對經篩選的標本進行圖像采集，包括病理切片標本、病原微生物封片標本、寄生蟲標本、宿主標本等合格標本的圖像采集。病理切片標本、病原微生物封片標本經篩選后，在顯微鏡下進行多角度、多方位的拍攝，如水霉的孢子囊和菌絲，石斑魚弧菌病感染的前期、中期、后期病灶發展的病理切片，整理成套為圖片集，能代表病原體的生活史和病害的發展規律。病毒類的病原體可增加電鏡觀察圖和PCR電泳檢測圖。對于大型的宿主標本則需要進行全方位的圖片采集以便于進行下一步的三維建模，每個標本需要拍攝40 ～50 張圖片。大型宿主標本首先要進行支撐架固定，然后放置在固定電動轉盤上，在合適的人造光源環境下進行全方位均勻的拍攝，以獲得曝光強度相同、分辨率一致、景深大小相同的照片［1，14］。

采集完后的照片可輸入到電腦中用圖像處理軟件如Photoshop進行處理，調整過曝、過暗的照片，棄用模糊、偏色的不合格的照片［15］。病害標本照片還應在照片上對典型的病理變化特征進行箭頭標注，并注明標尺和病灶特征描述文字。對于微生物封片的照片，還應標注微生物的生理結構組成部分和染色方法。大型標本的圖片經篩選處理后可用三維建模軟件進行三維影像合成，成熟的合成軟件有Strata Foto 3D［14］、Object2 VR［1］、AgiSoft PhotoScan［16］等。合成后的三維標本模型仿真度高，可任意旋轉縮放，體驗感大大提升。

3.3 數字化標本電子資源庫建設

將經過篩選、處理后合格的照片以及三維模型轉入電腦保存，并按照實體標本的分類排列進行整理，確保實體標本與數字標本一一對應。為了加強標本與生產實踐連接的緊密性，建立電子檔案，描述標本對應的病害病原體的基本信息概述、流行特點、致病機制、防治手段，并引入經典防治案例描述。為了拓展學生學習的途徑和延長學習時間，利用互聯網可隨時隨地訪問的優勢，將數字化標本電子資源庫上傳到服務器中，并在實體標本容器上貼上對應的二維碼。學生可以通過手機掃描二維碼或者電腦登錄網站訪問數字標本庫，可以在參觀標本庫時即時學習和課后拓展學習，拓展學習途徑和延長學習實踐。

目前實驗教學中心已經完成了部分水生動物病害的數字化標本的建設，并通過虛擬現實引擎Unity 3D來實現場景的交互和資源共享。在系統中，人們可以借助鼠標和鍵盤實現對標本進行縮放、結構分離、360°旋轉等操作（見圖2），點擊“描述與案例”還能調取數據庫中與該標本對應的病害的生物學信息和經典防治案例（見圖3）。在未來將有更多的水生動物病害數字化標本被制作并收入到數據庫中，進一步開拓標本庫的建設，為水生動物醫學的理論教學和實驗教學提供了豐富的教學材料。

圖2 部分水生動物病害數字標本系統展示圖

圖3 “描述與案例”資源調取圖

4 數字化標本在教學中的應用

4.1 數字化標本庫在水生動物病原生物學理論課上

的應用

在傳統的水生動物病原生物學理論課的教學中，對于不同水生動物病害的病原體的形態、宿主組織病理變化等形態學知識的講授，主要依靠文字描述結合黑白、彩色插圖的講解，講授方式單一，學生對病原體和組織病理的變化也停留在“二維”的平面認知上。當有了數字化標本庫資源后，教師在對理論知識的講授同時還可以利用資源庫中大量的數字標本來生動形象的展示病原體的形態、結構和宿主組織病理變化，讓學生的認知從“二維”的平面飛躍到栩栩如生的“三維”立體上。此外，資源庫中大量病害防治經典案例不但可以作為課堂上理論聯系實踐的實例講解的材料，還可以作為學生課余學習、科研的學習材料，豐富了學生的學習途徑，也延長了學習時間，加深了學生對水生動物病原生物學理論知識的理解。

4.2 數字化標本庫在實驗教學上的運用

水生動物病害標本是水生動物寄生蟲學、水生動物細菌學、水生動物檢驗檢疫學等實驗課程的重要教學工具。傳統實驗教學中，教師組織學生參觀實體標本并現場講解是主要的實驗教學方式。但由于標本經長期存放后，標本多已褪色，病灶和病變組織的觀察也局限于有限角度的觀察，而且和宿主一起的微生物病原體無法通過肉眼觀察。當建立數字化標本庫后，學生不僅可以現場觀察實體標本，還可以通過手機掃描標本容器對應的二維碼找到該標本對應的數字化標本，進行多方位的觀察，并可以細致的對病原體和病變組織進行放大縮小觀察，加深對病原體及其引起的病害的發生規律了解，提高了學生主動學習的興趣，改善了實驗教學效果。

4.3 數字化標本在其他方面的應用

隨著標本數量的擴充和標本庫建設的發展，標本庫的資源量也將以日俱增。標本庫的資源不僅可以作為學生課堂、課后的學習資料，還可以作為學生實驗考試的重要工具。利用數字標本庫進行實驗考試省時省力，且可以構建多種考核方式來督促學生學習，有利于提高教學質量和考試效率［11］。此外，數字標本庫建設完成后，數據庫還可以對外開放，為校外水產從業人員的水產動物病害的診斷、防控提供參考，同時也有助于擴充標本庫的來源，加強數字化標本庫在實踐上的應用。

5 結 語

我校水產學院多年來收集了大量的水生動物病害標本并建立了標本庫，在水生動物醫學人才培養方面發揮了重要的作用。但傳統標本庫在建設過程中難免遇到各種問題，如標本數量不足、鑒定分類不明確、保存不當等，且由于傳統標本庫自身的局限性，不能滿足實驗教學的需要，也不符合“雙一流”專業的建設對實驗室建設的要求。本文就現有的標本庫建設存在的問題提出了改造方案和數字化標本庫建造的方案，探討了數字化標本庫在理論教學和實驗教學上應用的優勢，為本校的標本庫以及其他院校的標本庫的改造和數字化建設提供了新思路。