高等級生物安全實驗室消毒滅菌關鍵技術與設備

黃 翠， 湯華山， 梁慧剛， 童 驍

（中國科學院a.武漢文獻情報中心；b.武漢病毒研究所，武漢 430071）

0 引 言

生物安全實驗室是科學家安全有效地開展傳染性物質研究的場所，它不僅保護研究人員不受感染，還防止有害微生物進入環境。生物安全實驗室按照防護級別的不同可分為：生物安全1 級實驗室（BSL-1）、生物

安全2 級實驗室（BSL-2）、生物安全3 級實驗室（BSL-3）和生物安全4 級實驗室（BSL-4）。高等級生物安全實驗室包括BSL-3 和BSL-4。生物安全實驗室的核心是“安全”，高等級生物安全實驗室開展高致病性病原微生物研究，更是如此。通過采取有效的消毒滅菌技術針對實驗室的目標物進行消毒和滅菌，是高等級生物安全實驗室預防人員感染、防止病原微生物外泄、保障試驗順利開展的一項有效措施。本文系統闡述高等級生物安全實驗室主要的消毒滅菌技術，以及關鍵消毒滅菌設備的特點和研發現狀，包括壓力蒸汽滅菌器、污水處理設備和氣（汽）體消毒設備。

1 高等級生物安全實驗室消毒滅菌關鍵技術

高等級生物安全實驗室的實驗物品或材料通過消毒滅菌后得到安全處理，對于防止病原微生物的積累和傳播發揮著關鍵作用。消毒一般是指使用一種液體化學品消除工作臺面和設備上除細菌孢子以外的幾乎所有病原微生物。滅菌是指使用物理或化學方法消滅所有微生物，包括高抗性的細菌內生孢子［1］。由此可以看出，相比消毒，滅菌殺滅微生物更徹底。高等級生物安全實驗室采用的消毒滅菌方法按照原理不同可分為化學法和物理法［2］。

1.1 化學法

化學消毒滅菌方法通常是指對無生命的物體使用化學殺菌劑或消毒劑。消毒滅菌效果受生物的種類和數量、有機物的數量、被消毒的對象以及化學品接觸時間、溫度和濃度等因素的影響。通過比較化學消毒劑作用在無生命物質表面的活性水平不同，作為選擇化學消毒方法與消毒劑分類的依據。

2020 年，美國疾病預防控制中心和國立衛生研究院聯合發布的《微生物和生物醫學實驗室生物安全（第六版）》［3］（BMBL6）中，按照殺滅微生物能力的不同，將化學消毒水平分為滅菌（sterilization）、高水平消毒（high level disinfection）、中水平消毒（middle level disinfection）和低水平消毒（low level disinfection）（見表1）。

表1 化學消毒水平

（1）液體消毒劑。BMBL6 還描述了實驗室常用液體化學消毒劑的消毒水平（見表2）。液體消毒劑的效果隨生物體、濃度、接觸時間和其他使用條件的不同而不同。沒有一種液體消毒劑在所有條件下對所有活病原體都有同樣的作用或效果。在生物安全實驗室中，液體消毒劑可用于表面去污，當使用足夠濃度時，可作為液體廢物最終排入衛生下水道之前的消毒劑。在實驗室的實際操作中，選擇的液體消毒劑都需要經過驗證對實驗研究的生物體有效。

表2 實驗室液體化學消毒劑的活性水平

在高等級生物安全實驗室中，可利用液體消毒劑對不透水的固體物體（如：不銹鋼桌面）進行表面消毒（通過制造商提供的產品使用方法和高等級生物安全實驗室內部實驗驗證），消毒后的混合液通過水槽或地漏輸送到液體污水凈化系統進行冗余處理。這種化學消毒方法的一個例子是化學消毒劑淋浴系統，在該系統中，穿著正壓服的研究人員在離開BSL-4 空間之前，通過化學淋浴順序有效地對他們的正壓服外面進行消毒［4］。此外，消毒劑還可用于對高等級生物安全實驗室產生的廢液進行消毒（該過程可以在排放到液體污水處理系統之前在容器中進行），消毒過程是將液體消毒劑與潛在污染的液體廢物溶液進行物理混合，溶液的具體比例、混合程度和接觸時間需要通過生物指標的驗證預先確定。

（2）蒸汽和氣體消毒劑。蒸汽和氣體消毒劑在封閉系統中和受控的溫度和濕度條件下使用時，可提供極佳的消毒滅菌效果。由表2 可以看出，在一定的條件下，使用戊二醛、甲醛、過氧化氫、二氧化氯、過氧乙酸等消毒劑可以達到滅菌的目的。高等級生物安全實驗室通常利用氣溶膠、蒸汽或氣相的戊二醛、多聚甲醛（paraformaldehyde）、過氧化氫、二氧化氯、過氧乙酸等對密封的實驗室房間、設備等進行氣（汽）體處理，以確保對空間內的所有區域進行徹底凈化，包括設備后面或組件面板內難以進入的空間。該方法主要用于凈化生物安全柜、動物房及其相關系統、不適用液體消毒劑的大型或固定設備、可能被其他消毒方法損壞的儀器或光學設備、房間、建筑物及相關的空氣處理系統等。目前越來越多的高等級生物安全實驗室利用汽化過氧化氫進行消毒滅菌。

1.2 物理法

高等級生物安全實驗室設備、廢棄物等的消毒滅菌還可通過物理加熱、輻射等來完成。

（1）加熱。實驗室的加熱滅菌技術可分為濕熱滅菌和干熱滅菌，其中濕熱滅菌是最可靠的滅菌方法，壓力蒸汽滅菌是最常用的一種濕熱滅菌方法。壓力蒸汽滅菌，有時也稱為蒸汽滅菌，是使用加壓蒸汽殺死傳染性病原和使蛋白質變性的方法，是迅速消滅所有形式的微生物最便捷的方法。壓力蒸汽滅菌器使用飽和蒸汽，在0.103 4 MPa的壓力下，腔室溫度在規定的時間（通常為30 ～60 min）內達到至少121°C。除了適當的溫度和時間外，防止空氣滯留對于實現無菌性也至關重要。要滅菌的材料必須與蒸汽和熱充分接觸。壓力蒸汽滅菌是一種對高等級生物安全實驗室設備和生物危險廢物進行滅菌的可靠方法。但需要注意的是，壓力蒸汽滅菌器不能去除化學污染。

干熱滅菌比濕熱滅菌效率低，需要更長的時間和/或更高的溫度才能達到滅菌效果。干熱滅菌適用于在不透水的非有機表面（如玻璃）上破壞活生物體，但在有可能充當隔熱層的淺層有機或無機材料存在的情況下，干熱不可靠。玻璃器皿的干熱滅菌通常可在160

～170°C的溫度下進行2 ～4 h。焚燒是一種非常有效的干熱滅菌方法，可用于廢棄污染物的最終滅菌和處置，還可用于微生物培養過程中接種針、接種環等的“點”滅菌。

（2）輻射。輻照主要用于滅活病原體，以便在較低的防護水平下進行研究，也可用于對小型固體、半固體或液體物質進行消毒滅菌。對于那些對熱和/或化學處理敏感的材料來說，這是首選的消毒滅菌方法。實驗室需要采取這種方法進行消毒滅菌的物品包括溶劑、塑料儀器或生物材料（如有機成分會因另一種消毒手段而遭到破壞的組織培養物）。輻射可分為電離輻射和非電離輻射。①電離輻射。電離輻射雖然可破壞微生物，但由于其對生物體的危害性，不是實驗室常用的滅菌工具。在某些特殊的情況下，電離輻射在少數高等級生物安全實驗室中有應用。輻照過程首先是將材料置于屏蔽室中，然后將其置于一定時間、一定劑量的伽馬輻照之下。伽馬射線由鈷-60 等放射性同位素產生，穿透材料的質量，通過電子的運動將少量的高強度能量傳遞給材料的分子。這個過程會破壞任何微生物的生存能力。伽馬射線照射是否成功地滅活微生物是通過生成“殺傷曲線”或“劑量反應曲線”來確定。也就是說，將病原微生物暴露在規定劑量的伽馬射線照射下，然后培養病原微生物以確定其生存能力［5］。②非電離輻射。紫外線（UV）輻射的UV-C 波段包含的波長（250 ～270 nm，265 是最佳波長）可以有效地消滅空氣和水以及表面的大多數微生物。生物體必須直接暴露在紫外光下，污垢、灰塵和陰影會屏蔽生物體，從而限制紫外燈的效果。紫外線輻射通常用于降低空氣中微生物的水平，并保持氣閘、動物飼養區、通風柜和實驗室房間等的良好空氣衛生。紫外線還用于生物安全柜（BSC）和一些實驗室房間的消毒滅菌，以減少表面污染。由于其穿透力差，對空氣流動敏感，需要較長的接觸時間而受到極大限制，不是有效的滅菌方法。

2 高等級生物安全實驗室消毒滅菌關鍵設備

2.1 壓力蒸汽滅菌器

國際和國內生物安全實驗室相關標準都明確規定，BSL-3 和BSL-4 必須配備蒸汽滅菌器。目前大多數標準蒸汽滅菌器都適用于BSL-1 和BSL-2 實驗室。但是，高等級生物安全實驗室要求蒸汽滅菌器具有標準蒸汽滅菌器設計所不具備的其他功能［6-9］。

（1）雙門設計。大多數高等級生物安全實驗室的蒸汽滅菌器有兩個門，門為聯鎖裝置，不允許兩個門同時打開。物品“通過”蒸汽滅菌器從受污染房間運送到潔凈房間。未經有效滅菌的實驗室廢棄物無法從滅菌器雙門通道帶出實驗室。生物安全型蒸汽滅菌器都有安全控制設計，這種機械安全功能有助于防止微生物從受污染的一側傳遞到未受污染的一側。換句話說，當一扇門打開時，另一扇門不能打開。門聯鎖系統是機電式的，即使在發生斷電或斷水的情況下，它也是安全的。防止兩扇門同時打開還有助于防止大量空氣通過滅菌器腔室，從而保持一致的空氣差。控制系統只有在電氣確認兩扇門都關閉后才會啟動循環。此外，非封閉一側的門是鎖定的，防止在滅菌循環中止或沒完成的情況下門被打開。

（2）生物密封。蒸汽滅菌器安裝在分隔兩個房間的墻壁開口中，設備主體與實驗室墻壁連接處需要做到密封。滅菌器自身的穿墻管線也需要專門設計有耐高溫和密封特性。適用于高等級生物安全實驗室的生物安全型蒸汽滅菌器配有生物密封法蘭或生物密封件。生物密封圈由鋼或不銹鋼板組成，連續焊接在滅菌器的四面。隔離墻法蘭的所有穿透口（無論是電線還是管道）都是完全密封的，以防止空氣泄漏。生物密封件可在危險側（封閉實驗室一側）和安全側（非封閉實驗室一側）之間提供隔離和可靠的密封，這對于保障人員安全至關重要。

（3）門墊圈密封。門墊圈通常由固態硅橡膠制成，厚度至少為6.35 mm。為保障安全，蒸汽滅菌器不依賴空氣或蒸汽的壓力來實現密封，而是依靠門關閉時對門密封墊圈的壓力。這被稱為“被動”墊圈設計。優點包括：如果被刺破，不會放氣；不需要空氣或蒸汽進行充氣；如果失去壓縮空氣或蒸汽，不會放氣；純機械密封，因此是安全的；在需要更換墊片時，無需工具或粘合劑即可更換，從而減少了維護時間。

（4）廢氣、廢水安全排放系統。美國塔夫茨大學的一項研究表明，各類蒸汽滅菌器在循環的預處理階段會通過腔室排水管排出細菌［10］。細菌可能成為氣溶膠，并排入地漏和周圍環境。因此，在將滅菌器廢氣、廢水排入環境之前，需要對其進行封閉、過濾或凈化。一般有3 種方法可對蒸汽滅菌器中的廢氣、廢水進行凈化處理，分別為：在蒸汽滅菌器的腔室內設置超高效HEPA過濾器；在蒸汽滅菌器的腔室外部安裝超高效HEPA過濾器；設置外部凈化室，污水被排放到一個外部凈化池中，在凈化池中加入蒸汽以消滅細菌。

國外生物安全型蒸汽滅菌器自上世紀90 年代開始生產，主要生產廠家有瑞典Getinge 公司和德國Systec公司。目前瑞典Getinge 公司的GEB 系列生物安全型蒸汽滅菌器產品在大型生物安全型蒸汽滅菌器（300L以上）市場中占據絕對優勢，德國Systec公司的D系列生物安全型蒸汽滅菌器產品在小型生物安全型蒸汽滅菌器（200L以上）市場中占據絕對優勢［11］。目前國內尚無完全符合高等級生物安全實驗室要求的生物安全型蒸汽滅菌器，僅山東新華醫療器械股份有限公司和江蘇連云港千櫻醫療設備有限公司開始了可在BSL-3 使用的生物安全型蒸汽滅菌器的相關研究。行業其他公司多為中小型規模企業，生產的產品趨于中低端，并且產品類型簡單、同質化嚴重，缺少對新型高端產品的研發和創新等。

2.2 污水處理設備

污水處理系統（Effluent Decontamination Systems，EDS）是處理所有實驗室廢水和生物防護設施內產生的污水所必需關鍵設備。實驗室污水通常來自實驗室內部房間的水槽、淋浴、地漏和高壓滅菌器。全球BSL-3 和BSL-4 實驗室都有要求對實驗室污水進行滅活處理。

EDS包括化學處理系統和熱處理系統，目前高等級生物安全實驗室較為常用的是污水熱處理系統。污水熱處理系統使用熱和壓力的組合，確保高等級生物安全實驗室產生的污水在排放到公共下水道之前，其中任何潛在的危險微生物病原體被破壞。例如，某BSL-4 實驗室房間配備了不銹鋼水槽和浮水槽，用于接收在日常實驗室活動中產生的化學凈化液體，水槽和地漏都連接到污水處理系統。在BSL-4 水槽和地漏的下游有3 個5.685 t的液體污水處理罐，通過加壓的蒸汽-熱傳導夾套，將污水處理罐內腔中的溫度提升到有效殺菌溫度，進入預定滅菌循環，循環結束后，液體被冷卻并排放到pH中和系統。

目前，根據運行方式的不同，高等級生物安全實驗室使用的污水熱處理設備可分為序批式污水熱處理設備和連續流式污水熱處理設備。二者根本區別在于序批式活毒廢水處理工藝將廢水儲存后再處理，連續式活毒廢水處理工藝則采取邊收集邊處理的方式。

（1）序批式污水熱處理設備。該系統采用蒸汽夾套式批處理系統，利用蒸汽夾套將處理腔室周圍的液體流出物加熱到滅菌溫度一段時間。然后，液體廢物在被排入衛生下水道系統之前被冷卻。包括序批式蒸汽系統和序批式蒸汽噴射系統。序批式蒸汽噴射系統是在序批式蒸汽系統的基礎上，在處理罐中增加了蒸汽噴射，通過組合加熱夾套和直接向污水負荷中注入蒸汽，加熱時間可以縮短一半。此外，直接蒸汽噴射還能攪拌污水，使熱量分布更均勻［12］。

（2）連續流式污水熱處理設備。連續流式污水熱處理系統包括一個緩沖儲存室，然后是一個密封泵，該密封泵將污水通過加熱熱交換器，然后通過一系列絕緣線圈，再通過冷卻熱交換器，最后排入下水道系統。密封泵在系統中保持恒定的流量，在設計系統前必須確定流量。通過流經一系列絕緣線圈，可將污水溫度在設定的時間內維持在滅菌溫度。線圈長度是根據污水流速設計的。加熱源可以是蒸汽、電或天然氣［13］。

目前，全球領先的污水熱處理設備制造商包括法國ACTINI公司，該公司的代表性產品為“ACTINI”連續流式污水熱處理設備；此外還有美國Bio-Response

Solutions公司，產品包括Bio-Response 序批式污水熱處理設備和連續流式污水熱處理設備。這些公司生產的污水熱處理設備已廣泛應用于全球高等級生物安全實驗室。我國山東新華醫療已成功研制出序批式污水熱處理設備，還未在國內高等級生物安全實驗室廣泛應用，需要進一步進行安全性和可靠性評價。目前尚無國產連續流式污水熱處理設備，還處于研發過程中［14］。

2.3 氣（汽）體消毒設備

使用液體消毒劑進行表面去污往往是最簡單的方法，是日常清潔的理想選擇。然而，當大面積和復雜的設備需要去污時，氣體方法或熏蒸劑往往是更好選擇。在這些情況下，液體消毒劑擦拭技術可能很耗時，難以標準化，可能根本不可行。在這些情況下，氣（汽）體凈化方法具有優勢，因為它們能夠覆蓋大面積的表面和更難到達的區域［15］。國內外相關標準/法律（如EC指令2009/41/EC）要求BSL-3 和BSL-4 在出現意外泄漏或日常維護后，必須使用可靠和有效的方法進行全室消毒處理。

目前，世界上用于生物安全實驗室消毒的氣（汽）體消毒劑主要有甲醛、氣體二氧化氯（GCD）和汽化過氧化氫（VHP）。與甲醛和GCD 相比，VHP 使用更安全，不致癌，且對環境友好，因此近年來越來越多的高等級生物安全實驗室采用VHP 對實驗室空間和大型設備進行消毒滅菌。

目前市面上的過氧化氫蒸汽發生器多數是由英國Bioquell和美國Steris 公司生產［16］，此外還有德國PEA Geschko 汽化過氧化氫發生器。這里以美國Steris公司的一款過氧化氫蒸汽發生器Steris VHP 1000-ARD系統［17］為例說明，該系統使用的是35%過氧化氫溶液（Vaprox?），去污過程包括4 個階段：①除濕。通過集成的干燥劑系統去除房間內的濕度。②調節。Vaprox?被汽化，并由發生器注入房間，以迅速提高VHP的水平至有效濃度。③去污。通過不斷向房間內注入VHP 來維持VHP 濃度，以有效殺滅微生物。④通風。停止注入VHP，利用送風和排風清除室內的VHP。

浙江泰林生物科技有限公司和上海東富龍科技有限公司開發了用于生物安全實驗室的移動式VHP 消毒設備，分別代表了“干法”和“濕法”VHP 消毒設備的兩個方向。目前國內高等級生物安全實驗室仍以進口VHP 消毒器設備為主，國產VHP 消毒設備有小范圍應用，國內相關企業在技術成熟度和產品研發升級等方面正在不斷提升。

3 結 語

安全有效的消毒滅菌對于保障高等級生物安全實驗室的“安全”至關重要。近年來，我國已建成了一批高等級生物安全實驗室，截至2018 年9 月，我國通過中國合格評定國家認可委員會認證認可的BSL-3 有78 個，建成的BSL-4 有3 個［18］。2016 年，國家發展改革委和科技部共同發布《高級別生物安全實驗室體系建設規劃（2016 ～2025 年）》，計劃加快建成我國高等級生物安全實驗室體系。但由于我國高等級生物安全實驗室特別是BSL-4 建設起步較晚，符合相關要求和標準的國產消毒滅菌技術與設備研發還沒有跟上，無法滿足國內高等級生物安全實驗室發展和建設的需求，因此相關技術和設備主要依賴進口，除了價格昂貴之外，還存在設備維修和維護不便等問題。我國亟須在高等級生物安全實驗室消毒滅菌技術方面加強探索、突破瓶頸、推動創新，提升我國在相關領域的技術成熟度和創新能力，加強國產消毒滅菌設備的實踐檢驗和認證認可，徹底改變我國高等級生物安全實驗室消毒滅菌技術和設備長期以來受制于人的局面。