AT1aR敲除改善高脂飲食誘導的大鼠胰島素抵抗

史文娟，王雪嬌，雷占東，蘇琬真，張翼超，焦向英

(山西醫科大學生理學系，細胞生理學教育部重點實驗室，山西 太原 030001)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指胰島素發揮作用的靶器官、靶組織，如肝臟、脂肪、骨骼肌等對胰島素的敏感性降低，導致這些組織對葡萄糖的攝取利用能力下降，血糖升高，機體出現糖代謝紊亂[1]。IR是2型糖尿病發生發展的重要環節，是2型糖尿病的病理基礎[2]。肥胖是IR發生的重要風險因素，肥胖患者大多會出現IR，近年來，隨著肥胖癥患病率在全球范圍內與日劇增，2型糖尿病的發病率也在逐年上升。因而，改善肥胖癥患者的IR對于2型糖尿病的防治具有重要意義。

胰島素作用于脂肪組織，促進脂肪組織脂質合成。除了能量儲存，脂肪組織也是重要的內分泌器官，在肥胖發生的過程中，脂肪組織分泌功能紊亂也會造成胰島素抵抗。此外，白色脂肪組織的胰島素信號通路也參與調節肝臟糖異生，從而影響糖代謝[3]。所以，脂肪組織IR對機體糖脂代謝有重大影響，改善脂肪組織IR對于恢復肥胖患者糖脂代謝穩態，預防2型糖尿病有重大意義。

腎素血管緊張素系統(renin-angiotensin system, RAS)的研究已有120多年的歷史，其經典的生理作用是調節機體血壓和水鹽的平衡。其中，血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)是該系統發揮生物學作用的主要受體，針對該受體的阻滯類藥物(angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers, ARB)是臨床上經典的降壓藥，在高血壓及心力衰竭等心血管疾病的防治中發揮重要作用。機體除了循環系統的RAS，各組織器官也存在局部RAS。近年來，由于與代謝紊亂密切相關，脂肪組織RAS也受到越來越廣泛的關注。動物研究顯示[4]，脂肪組織過表達血管緊張素原(angiotensinogen, AGT)可導致脂肪組織炎癥及胰島素抵抗。此外，臨床發現ARB類藥物在抵抗肥胖、胰島素抵抗及糖尿病等代謝性疾病方面也具有積極作用[5-6]。但是，由于ARB的不依賴于AT1R的PPARγ激動樣作用[7]，所以在代謝研究方面，ARB并不能完全模擬AT1R抑制的情況，導致AT1R在胰島素抵抗等代謝紊亂疾病方面的作用及機制尚不清楚。

因而本研究通過建立AT1aR敲除大鼠模型來探究AT1R在胰島素抵抗發生發展中的作用。實驗發現AT1aR敲除可以明顯改善高脂飲食誘導的胰島素抵抗，這表明AT1aR可能成為改善糖尿病患者胰島素抵抗的新靶點，同時本研究也希望為ARB類藥物的臨床應用提供基礎理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料4周齡的SPF級♂SD大鼠購于山西醫科大學實驗動物中心，動物合格證號為：SCXK(晉)2015-0001和AT1aR基因敲除的♂SD大鼠(XM003006,南京大學-南京生物研究院)各12只。所有大鼠均喂養于山西醫科大學生理系SPF級動物實驗室內，溫度(25±2)℃，12 h晝夜交替，動物可自由飲水和攝食，所有動物實驗的操作過程均符合山西醫科大學動物倫理學標準，并經過了倫理委員會批準。

PCR引物(Tab 1)、總RNA提取試劑、反轉錄、擴增試劑均購于日本TaKaRa公司，；免染SDS-PAGE凝膠制備試劑購自美國Bio-Rad公司；胰島素ELISA試劑盒(CEA448Ra)購自武漢云克隆公司；山羊抗兔二抗購于武漢博士德生物工程有限公司；P-AKT(ser473)(9271S)、AKT(9272S)、IR(3025S)、Glut4及β-actin一抗均購于CST；PKCα、PKCε、PKCη、PKCβ1、PKCβ2、PKCδ一抗均購于Abcam公司。

Tab 1 Primer sequence for PCR

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型的建立 4周♂SD大鼠和AT1aR基因敲除的大鼠各自隨機分為正常飲食組(normal diet group, ND)和高脂飲食組(high fat diet group，HFD)。HFD組以60%的高脂飼料(D12492，北京惠特比科技有限公司)、ND組以普通飼料喂養12周，成功建立肥胖模型。取雙側附睪脂肪組織，觀察脂肪組織形態。

1.2.2血清胰島素水平測定 大鼠提前禁食不禁水10 h，麻醉后進行腹主動脈采血，獲得全血于負壓采血管內，室溫靜置2 h后離心獲取血清標本。按照胰島素ELISA試劑盒(CEA448Ra)的操作說明測定大鼠血清胰島素水平。

1.2.3胰島素抵抗指數(HOMA-IR)的計算 測定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)及空腹血清胰島素水平，HOMA-IR=FBG×空腹血清胰島素/22.5。

1.2.4Western blot 取大鼠的附睪脂肪組織0.3 g，加入裂解液、PMSF、磷酸酶抑制劑(分別為100: 1: 1)，用組織研磨儀低溫勻漿。靜置1 h后12 000 r·min-1離心20 min，吸取中層清亮液體，得到脂肪組織蛋白。接著根據BCA試劑盒(凱基生物)測量蛋白濃度，統一各樣本每孔上樣量到25 μg。在蛋白樣本中加入裂解液和loading buffer后，置于100 ℃，5 min，使之變性，冷卻至室溫后置于-40 ℃備用。聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后將蛋白由膠轉至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉或BSA封閉3 h、TBST清洗(7 min，3次)、一抗孵育4 ℃過夜，其中P-AKT(ser473)、AKT、IR及Glut4的一抗濃度為1 ∶1 000；PKCα為1 ∶5 000；PKCβ2為1 ∶1 000；PKCε、PKCη、PKCβ1、和PKCδ的抗體濃度為1 ∶2 000；β-actin為1 ∶8 000。次日，TBST清洗(7 min，3次)后加入二抗孵育3 h、TBST清洗(7 min，3次)，曝光。用ImageJ軟件分析其灰度值，并進行統計。

1.2.5Real-time PCR

1.2.5.1 RNA提取及反轉 取大鼠附睪脂肪組織0.1 g，加入TRI提RNA，Nanodrop One測RNA濃度，根據RNA反轉錄試劑盒的說明要求將RNA反轉為cDNA。

1.2.5.2 擴增 根據RNA擴增試劑盒的操作說明，利用熒光定量PCR儀(LightCycle 96SW)對所獲得的cDNA進行擴增，比較其CT值，并計算2-ΔΔCT值進行統計學分析，見Tab 2。

Tab 2 Gene name and primer sequence for RT-PCR

2 結果

2.1 AT1aR敲除肥胖大鼠模型建立鼠尾提取大鼠DNA，PCR鑒定基因型，如Fig 1A結果顯示，1～6均為AT1aR敲除純合子大鼠，7～12為野生型大鼠。兩種基因型大鼠各自用普通飼料和高脂飼料喂養12周后，高脂喂養的WT鼠的腹腔脂肪組織明顯多于普通飼料喂養的WT鼠。其次，高脂組WT鼠的腹腔脂肪組織也明顯多于同組AT1aR-/-鼠(Fig 1B)。完整分離雙側附睪脂肪組織，觀察其實物形態，如Fig 1C結果顯示，高脂喂養的WT大鼠的附睪脂肪組織明顯大于普通飼料喂養的WT大鼠，且高脂組AT1aR-/-鼠的附睪脂肪組織也明顯小于同組WT鼠。

2.2 AT1aR敲除改善高脂飲食大鼠的胰島素抵抗胰島素抵抗指數(HOMA-IR)是評價機體胰島素抵抗的重要指標[8]。本研究發現，普通飼料正常喂養的情況下，AT1aR-/-鼠和WT鼠的HOMA-IR無明顯差異，但是高脂喂養的AT1aR-/-鼠的HOMA-IR明顯低于同組WT鼠(P<0.05)(Fig 2C)。上述結果表明，AT1aR敲除可以明顯改善高脂飲食誘導的胰島素抵抗。此外，高脂組AT1aR-/-鼠的空腹血糖也明顯低于WT鼠(P<0.05)(Fig 2A)。血清胰島素水平僅在高脂和普通喂養的WT鼠間有差異(P<0.05)(Fig 2B)。

2.3 AT1aR敲除改善高脂誘導的胰島素信號通路受損肥胖患者體內胰島素信號通路受損，發生胰島素抵抗。脂肪組織是胰島素發揮作用的重要組織，因而通過對脂肪組織胰島素信號通路關鍵蛋白的檢測，發現高脂喂養后AT1aR-/-鼠脂肪組織的胰島素受體(insulin receptor, IR)表達水平、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)磷酸化水平以及GLUT4(glucose transporter 4, GLUT4)的表達水平均明顯高于同組WT大鼠(P<0.05)(Fig 3)，這說明AT1aR敲除可以通過增強胰島素信號通路蛋白的表達改善高脂引起的胰島素信號通路受損。

Fig 1 Successful construction of obesity rat model

Fig 2 AT1aR knockout improved insulin resistance induced by high-fat n=6)

Fig 3 AT1aR knockout enhanced insulin signaling

2.4 AT1aR敲除抑制脂肪組織PKC的表達眾多研究均表明蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)抑制可以改善胰島素抵抗，因而對高脂飲食的WT和AT1aR-/-鼠脂肪組織PKC各亞型的表達情況進行分析，發現AT1aR敲除明顯降低PKCα、PKCε、PKCη的表達(P<0.05)，而對PKCβ1、PKCβ2、PKCδ的表達無明顯影響(Fig 4)。這一結果表明，AT1aR敲除主要通過抑制PKCα、PKCε及PKCη的表達而改善IR。

2.5 AT1aR敲除促進成脂分化在肥胖發生的過程中，促進成脂分化可以改善胰島素抵抗。通過RT-PCR對大鼠附睪脂肪組織內與成脂分化相關的因子進行觀察，其中，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)和固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding protein, SREBP-1c)均是成脂分化的正向調控因子。實驗發現在高脂喂養的情況下，AT1aR-/-鼠脂肪組織內PPARγ與SREBP-1c的基因表達水平均高于WT鼠(P<0.05)(Fig 5)，說明AT1aR敲除可能通過促進脂肪組織分化來改善胰島素抵抗。

Fig 4 AT1aR knockout inhibited PKC expression

Fig 5 AT1aR knockout promoted adipogenic

3 討論

肥胖患者通常會發生胰島素抵抗，長期的胰島素抵抗使機體糖代謝紊亂，血糖升高會造成2型糖尿病的發生發展。因而肥胖患者IR的改善對于預防及控制2型糖尿病的發生發展具有重要意義。本研究發現，AT1aR敲除可以通過增強胰島素信號通路、抑制脂肪組織PKC的表達、促進成脂分化明顯改善高脂誘導的胰島素抵抗，這提示AT1aR抑制對于改善2型糖尿病患者的糖代謝紊亂可能有重要作用。RAS的經典作用是對機體水鹽平衡及血壓的調節，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)是RAS的關鍵因子，而AT1R是Ang Ⅱ發揮生物學作用的主要受體。針對AT1R的阻斷劑即ARB類藥物已經作為降壓藥廣泛應用于臨床，但近年來越來越多的研究發現ARB類藥物可以延緩2型糖尿病的發病進程[9]，這與本研究的結論也具有一致性，因而本研究也有望為ARB類藥物在糖尿病等代謝疾病的臨床應用方面提供理論支持與指導。

與人類不同，嚙齒類哺乳動物的AT1R由2個具有大量同源序列的基因編碼產生，有AT1aR和AT1bR兩種亞型[10]。其中AT1aR表達于脂肪組織、腎臟、肝臟、腎上腺、卵巢、腦、睪丸、心臟、肺臟、胎盤等大多數器官，主要參與血管的舒縮反應，調節血壓，與人類的AT1R最具同源性。而AT1bR主要存在于中樞神經系統的某些區域和腎上腺組織中，與哺乳動物的饑渴反應相關[11]。故而，本研究通過建立AT1aR基因敲除大鼠來盡可能模擬人體，探究AT1R在肥胖中的作用。

胰島素通過與細胞膜上的胰島素受體結合，激活下游的胰島素受體底物，進而使胰島素信號通路的主要蛋白AKT磷酸化激活，最終促進GLUT4的表達及膜轉位，從而加強細胞對葡萄糖的攝取，降低血糖。胰島素抵抗患者的胰島素信號通路蛋白表達水平降低，細胞對葡萄糖的攝取作用減弱，出現高血糖。本研究顯示，AT1aR敲除可以明顯增強胰島素信號通路蛋白的表達進而改善肥胖引起的胰島素抵抗。

AT1aR敲除改善胰島素抵抗與其抑制PKC的表達有密切關系。PKCs在細胞生長、分化方面具有重要意義[12]，主要分為3大類，分別是傳統型PKC (α、β1、β2和γ)、新型PKC (δ、ε、η和θ)和非典型PKC(ζ、λ/τ)。其中傳統型PKC和新型PKC是脂質敏感性激酶，可使胰島素受體底物的ser307及ser302磷酸化，而抑制胰島素誘導的受體底物磷酸化，從而抑制胰島素信號傳導，產生胰島素抵抗[13-14]。糖尿病人群的PKC活性顯著升高，抑制PKC可以明顯改善糖尿病患者的胰島素抵抗[15]。Ang Ⅱ作用于AT1R進而通過甘油二酯-三磷酸肌醇激活下游的PKC，因而AT1aR敲除可以通過抑制PKC的表達從而改善胰島素抵抗。

成脂分化是由前體脂肪細胞和間充質干細胞形成新的脂肪細胞的過程，PPARγ在脂肪組織內高表達，調控脂肪細胞的分化[16]，SREBP-1c與PPARγ一樣均是促進成脂分化的因子，AT1aR敲除可以促進這兩種因子的轉錄，這提示AT1aR敲除大鼠的成脂分化增加。有研究表明[17]，高濃度Ang Ⅱ會抑制人和動物的成脂分化，其機制可能與AT1R介導的細胞外調節蛋白激酶1/2和絲裂原活化蛋白激酶通路的激活有關[18]，這與本實驗的研究結果具有一致性。肥胖患者能量攝入遠大于消耗，過量的能量以甘油三脂的形式儲存在脂肪組織，引起脂肪細胞肥大，而肥大的脂肪細胞功能障礙，對胰島素的敏感性降低，進而發生胰島素抵抗。隨著成脂分化的增強，脂肪細胞數量增加，新的脂肪細胞產生，而新生的脂肪細胞對胰島素的敏感性增強。因而AT1aR敲除可通過促進成脂分化，改善胰島素抵抗。

總之，本實驗結果顯示，AT1aR敲除可以通過增強胰島素信號通路、抑制PKC的表達以及促進脂肪組織分化改善高脂誘導的胰島素抵抗，這對2型糖尿病的預防及治療有重要意義。