基于網絡藥理學和分子對接分析大黃治療急性胰腺炎的分子作用機制

陳小霞，謝彩杏，，梁毅鋒，，秦百君，楊 昕，鄭日輝，陳國忠

(1.廣西中醫藥大學第一臨床醫學院， 2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530001)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由多種病因引起胰酶激活，繼以胰腺局部炎性反應為主要特征，伴或不伴其他器官功能改變的常見消化系統危重病。隨著人們飲食結構的豐富，我國AP的發病率不斷增加，總體病死率達5%～10%，具有發病急、病情重和并發癥多等特點[1]。在AP急性期，機體腸道功能紊亂常引起腸粘膜屏障功能障礙，使患者出現腸麻痹、腸梗阻、全身炎癥反應綜合癥，甚至是多器官功能障礙綜合征。因此，及時進行早期干預是防止AP發生轉變、惡化的首要任務。但是，目前在AP早期，西醫以非手術的對癥治療為主，預后較差，常因治療不徹底導致復發。

中醫學認為，AP病理性質以里、實、熱證為主。基本病機是“腑氣不通”，各種致病因素引起氣機不暢，痰濕內蘊，郁久化熱，久則血瘀、濁毒漸生，有形邪實阻滯中焦，從而導致“腑氣不通，不通則痛”[2]。大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒等功效，正契合AP的病理特點。如《神農本草經》所言：“大黃，主下瘀血，血閉寒熱，破癥，積聚，留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷”。并且課題組在中醫復方治療AP的520篇文獻中發現，以大黃為君結合病理因素進行配伍和組方的較多，根據“急則治標”的原則，將大黃貫穿于AP治療的始終，可極大程度地降低患者手術率、病死率及復發率[3]。而且現代藥理研究也提示，以單味中藥，如生大黃內服或灌腸可以明顯調節大鼠腸道菌群，抑制腸道炎癥反應[4]；加入大黃的復方制劑，如清胰湯、大承氣湯等類方均有緩解腸麻痹等作用。但是，大黃成分多、傳統功效和現代藥理機制復雜，當前研究局限于單一方向，在AP中的作用機制尚不明確。

網絡藥理學是一種系統網絡分析的新方法，能從分子水平觀察藥物活性成分、蛋白質、基因和疾病之間的相互關系，有利于系統性闡明大黃的藥物療效和治療AP的規律，為進一步實驗驗證提供研究基礎，為藥物的開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1本文所使用的工具如下 (1)數據庫：TCMSP v2.3、TCMID、Swiss Target Prediction、Uniprot Updated to 2020、Gene Cards v1.5、OMIM Updated to 2020、STRING v11.0、Metascape Update to 2020-09-16、PubChem、PDB；(2)軟件：UltraEdit v22.20.0.43、Perl語言v5.26、R語言v4.0.3、Cytoscape v3.6.0、Chem 3D v14.0、AutoDock Vina v1.1.2、Autodock Tools v1.5.6、Pymol v1.7。

1.2 提取大黃活性成分和靶點(1)在TCMSP和TCMID數據庫中檢索大黃的活性成分，并將前者的中藥成分按關鍵ADME屬性值：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18篩選，綜合考慮藥理活性和機體利用度[5]；(2)在TCMSP和Swiss Target Prediction數據庫中查詢大黃的靶點；(3)通過查詢中國知網、PubMed數據庫補充大黃最新的活性成分和靶點；(4)匯總上述大黃活性成分和靶點，去除重復值；(5)運用Perl語言在Uniprot數據庫中將靶點名稱進行基因名稱轉換，靶點為其他物種基因或無對應關系則刪除；(6)用Cytoscape軟件構建大黃“活性成分-藥物靶點”網絡，用network analyzer插件進行拓撲分析。

1.3 提取AP的靶點、大黃與AP的共同靶點以“Acute pancreatitis”為關鍵詞，在常用疾病數據庫GeneCards、OMIM中檢索AP的靶點，去除重復值，并與1.2所得大黃的靶點取交集。

1.4 構建大黃治療AP的“活性成分-疾病靶點”網絡在Cytoscape軟件中用文本文檔和Excel文件構建大黃與AP的網絡關系，并進行拓撲分析，突出大黃治療AP關鍵的活性成分和靶點。

1.5 構建蛋白相互作用網絡(protein-protein interaction，PPI)STRING是根據已知蛋白相互作用進行預測的數據庫。將1.3所得的大黃與AP的共同靶點導入，物種限制為人類，隱藏游離點，設定置信度>0.4，其他保持默認設置，導入Cytoscape軟件進行拓撲分析。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)生物過程富集分析Metascape數據庫是一個功能強大、更新快、覆蓋廣的基因功能注釋分析工具，能分析大批量的基因或蛋白功能。將1.3所得的大黃與AP共同靶點導入，限定物種為人類，P≤0.01。

1.7 京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析將1.3所得的大黃與AP共同靶點導入R語言，獲得KEGG通路富集結果，并借助R語言對關鍵靶點和關鍵通路進行分析。

1.8 分子對接驗證(1)小分子化合物處理：將1.2和1.4中得到的大黃關鍵活性成分取交集，選取排名前三的，和目前治療AP的主要西藥：奧曲肽、加貝酯，在PubChem中分別下載sdf格式，導入Autodock Tools轉存為pdbqt格式。(2)大分子蛋白處理：將1.4和1.5中大黃的關鍵靶點取交集，選取排名第一的在PDB數據庫下載其pdb格式：人源蛋白優先；有蛋白與配體的復合物；最好蛋白的配體與AMD的結構類似。再導入Pymol中去除水分子、分離配體，在Autodock Tools中加氫、加電荷，轉存為pdbqt格式。(3)設置活性口袋，利用Autodock Vina進行分子對接，計算結合能。

2 結果

2.1 研究步驟在TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction數據庫中分別檢索大黃的活性成分及靶點，在Gene Cards、OMIM數據庫篩選AP靶點，并獲得大黃與AP共同靶點。然后分別將共同靶點導入Metascape數據庫進行GO富集分析、R語言進行KEGG富集分析、STRING數據庫構建PPI網絡。另外，通過Cytoscape軟件分別構建大黃“活性成分-藥物靶點”網絡、大黃治療AP的“活性成分-疾病靶點”網絡，篩選出大黃治療AP的核心活性成分及靶點。最后通過分子對接初步驗證其結合能力。

2.2 大黃的活性成分和靶點在TCMSP和TCMID數據庫中共得到192個大黃活性成分，查閱文獻補充后去除重復值，最終得到16個，詳見Tab 1。在TCMSP和Swiss Target Prediction數據庫中得到大黃的靶點去重后剩645個。然后運用Perl語言在Uniprot數據庫中將靶點名稱進行基因名稱轉換，將所得的大黃活性成分和轉換后的靶點基因進行映射，導入Cytoscape軟件，形成由62個節點(表示大黃的活性成分和靶點)，81條邊(表示成分與靶點之間的相互作用)構建的大黃“活性成分-藥物靶點”網絡，平均節點值為1.3。并進行拓撲分析，設置Degree≥平均節點值(即≥2)，突出大黃自身關鍵的活性成分和靶點。

Tab 1 Rhubarb active ingredient list

2.3 AP的靶點、大黃與AP共同靶點在GeneCards數據庫中得到AP靶點1 700個，將靶點相關性評分設定為≥中位數值(即≥5.12)，保留相關性較大的靶點[6]。同時，在OMIM數據庫得到182個，與2.2所得大黃的靶點取交集，在微生信平臺構圖，得到31個大黃與AP共同靶點。

2.4 大黃治療AP的“活性成分-疾病靶點”網絡將2.2所得的31個共同靶點運用Perl語言映射出對應的大黃活性成分，構建網絡和屬性文件導入Cytoscape軟件，得到由38個節點和54條邊構建成的網絡，并進行拓撲分析，節點按Degree值進行排序。然后計算所有節點的Degree值、中心度值(Betweenness centrality，BC)、緊密中心度(Closeness centrality，CC)的平均節點值進一步篩選，當設置Degree≥2，BC≥0.12，CC≥0.40時，選出綜合條件最高的前三個。

2.5 PPI網絡在STRING數據庫得到由27個節點，135條邊構建的PPI網絡，并進行拓撲分析，設置Degree≥5(平均節點值為5)，突出相互作用密切的靶點。由Fig 5可見，CASP3、JUN、HSP90AA1等為關鍵靶點。

Fig 1 Rhubarb “active ingredient-drug target” network

Fig 2 Common target of rhubarb and AP

Fig 3 The “active ingredient-disease target” network of rhubarb in treatment of AP

Fig 4 PPI network

Fig 5 GO enrichment analysis

Fig 6 KEGG enrichment analysis

Fig 7 p53 signaling pathway

Fig 8 Molecular docking binding energy

Fig 9 A detailed simulation diagram of molecular docking

2.6 GO富集分析在Metascape數據庫中得到137個細胞生物過程，根據Count值將前20個導出，其中每個節點代表一個富集的術語(term)，相似度>0.3的term通過邊連接，匯聚成功能團，根據功能團的score設置邊的透明度，突出重要性。其中主要包括對有毒物質的反應(response to toxic substance)、節律過程(rhythmic process)、對非生物刺激的反應(cellular response to abiotic stimulus)、對氧氣水平的反應(response to oxygen levels)、活性氧代謝(reactive oxygen species metabolic process)、DNA損傷的信號轉導(signal transduction in response to DNA damage)、凋亡信號通路(apoptotic signaling pathway)等。

2.7 KEGG富集分析在R語言運行數據后得到87條信號通路，根據Count值展示前20條陽性率較高的通路，縱坐標表示信號通路，橫坐標表示富集倍數，氣泡大小表示富集基因的數量，不同顏色表示P值大小。在國內外文獻，如中國知網、PubMed等查閱與AP相關且顯著富集的通路，可知所得的乙型肝炎(Hepatitis B)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、細胞周期(cell cycle)、凋亡(apoptosis)等與AP相關。其中，結合文章所得關鍵靶點對排名靠前且與AP有密切聯系的p53信號通路進一步構圖分析。

2.8 分子對接模型課題組綜合考慮藥物本身作用及藥物治療疾病作用兩方面，取2.2大黃“活性成分-藥物靶點”網絡和2.4大黃治療AP的“活性成分-疾病靶點”網絡排名前三的大黃活性成分、2.4大黃治療AP的“活性成分-疾病靶點”網絡和2.5 PPI網絡排名前五的交集靶點作為大黃治療AP的核心活性成分及靶點。將2.2和2.4的大黃活性成分取交集可知，大黃治療AP主要且核心的前3個活性成分為beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN。將2.4和2.5的靶點取交集可知，大黃治療AP核心的靶點蛋白為HSP90AA1。基于此，課題組認為beta-sitosterol(PubChem CID：222284)、aloe-emodin(PubChem CID：10207)、EUPATIN(PubChem CID：5317287)作用于HSP90AA1(PDB ID:3q6n)是大黃治療AP的關鍵，并通過分子對接進行初步驗證。而目前治療AP的奧曲肽(Octreotide)(PubChem CID：448601)、加貝酯(Gabexate)(PubChem CID：3447)作為分子對接的陽性對照，同樣進行相同操作。Autodock Vina軟件中結合能<-5 kcal·mol-1說明小分子與大分子結合性很好，且值越小表示越可能自發結合。本次對接結合能均<-5 kcal·mol-1，并且beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN的結合能明顯小于兩個西藥的結合能。將結合能最低的前二組對接細節展示，可見小分子結合在蛋白的活性口袋，并且aloe-emodin與HSP90AA1活性位點的TYR-364、ARG-346、ARG-345、ARG-386形成5個氫鍵相互作用，EUPATIN與HSP90AA1活性位點的PHE-369、ARG-386形成2個氫鍵相互作用，氫鍵通過原子間的虛線連接，提示分析所得的大黃關鍵活性成分與核心靶點之間結合性很好、構象穩定和生物活性高。

3 討論

中醫將AP歸屬于“腹痛”“胰癉”等范疇，在利用大黃治療AP的臨床實踐中有著歷史悠久且獨具特色的經驗。利用系統的網絡藥理學結合分子對接對其在AP中發揮的作用機制進行分析，將能較大程度的在大黃多個靶點、多個通路中預測與AP密切聯系的靶點、通路，從而提高臨床實驗效率，在進一步的實驗驗證中獲得重大突破，為臨床用藥增加中醫自信。

在本文中，課題組綜合結果分析可知，大黃治療AP主要且核心的前3個活性成分為β-谷固醇(beta-sitosterol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、澤蘭黃醇(EUPATIN)，即是大黃本身主要的活性成分，也是大黃治療AP核心的藥效成分。beta-sitosterol是一種最常見的的天然植物固醇，能影響細胞膜結構，參與調節膜的相關代謝，具有降脂、抗炎等生物活性[7]。其通過減少腸道對膽固醇的吸收，能減少胰腺中游離脂肪酸的大量積累，避免活性氧簇和活性氮簇大量生成，從而抑制氧化應激機制啟動，減少對胰腺細胞的脂毒性和炎性損傷[8]。另外，促炎和抗炎細胞因子的平衡對于AP炎癥的進展至關重要。據報道，beta-sitosterol可下降TNF-α、IL-1β、IL-2等促炎細胞因子水平，升高IL-10和TGF-β等抗炎細胞因子水平，并降低VEGF和NF-kB表達，增加HO-1，Nrf-2表達，即抑制NF-kB，激活HO-1/Nrf-2途徑，從而表現出減輕組織炎癥水腫，改善微循環障礙的作用[9]。表明beta-sitosterol有通過降脂、抗氧化應激和抗炎，降低高脂血癥胰腺炎往重癥發展的趨勢。眾所周知，aloe-emodin存在于蘆薈、大黃等多種中藥中，是大黃蒽醌類屬中較為重要的部分，初步證明本文2.1中預測大黃活性成分的可靠性。其通過清除氧自由基，減少脂質過氧化物的堆積，避免了脂質過氧化損傷，達到降低血脂目的的同時，還防止了胰腺組織的壞死[10]。并且，Gao等[11]發現，aloe-emodin能通過Nrf2/HO-1信號傳導途徑，抑制NLRP3炎性體激活，抑制促炎細胞因子的產生，下調caspase-1水平，有效地保護大鼠免受AP損傷。這正是對aloe-emodin治療AP機制的進一步探索。另一方面，NO由NOS的酶家族產生，不僅在胰島中表達，也在胰腺外分泌區室和脈管系統中，而黃花蒿屬植物中的多甲氧基黃酮類化合物EUPATIN已明確具有減少NO的作用，能明顯降低AP大鼠的p65、iNOS、IL-6表達，減弱巨噬細胞中NF-κB依賴性炎癥，從而緩解AP早期的炎癥因子風暴[12]。在2.8的分子對接中beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN與AP的主要靶點HSP90AA1結合能明顯小于兩個西藥的結合能，正是大黃在治療AP中生物活性較高的體現。此外，HSP90AA1是HSP90家族最重要的熱激蛋白之一，是真核生物必不可少的伴侶蛋白，能調節蛋白激酶、轉錄因子和細胞信號蛋白的穩定性和活性，并與信號轉導或信息處理有關的蛋白質保持聯系[13]。其在中毒、缺氧等應激條件下會被激活，能被IL-2、NF-kB或RELA誘導表達，與急性損傷和炎癥相關，常提示預后不良[14]。這就產生了一個陽性的反饋回路，易在炎癥部位引起炎癥性風暴。然而目前大量的研究表明，抑制HSP90AA1可通過泛素-蛋白酶途徑和NF-kB信號通路增加其伴侶蛋白質降解，阻斷信號通路的激活，并引起巨噬細胞和其他細胞因子的后續損失，顯著減輕炎癥反應[15]。

另一方面，對GO富集分析的137個細胞生物過程分析得知，有毒物質、非生物刺激、氧氣水平、活性氧的代謝、DNA損傷、凋亡等大多與AP的發生發展相關。KEGG富集分析中得到87條信號通路中顯著富集在p53信號通路。p53位于17p染色體上，是細胞生存或凋亡的“分子開關”，可調節DNA修復、細胞增殖和凋亡等，在DNA損傷誘導的細胞凋亡中發揮著重要作用[16]。正常情況下，p53與MDM2的產物相互作用且保持在較低水平。當細胞受有毒物質等刺激時，發生DNA損傷，ATM識別受損的DNA分子進而磷酸化Chk2，活化的Chk2又進一步磷酸化PARC，從而增加p53蛋白的表達[17]；另外，ATM也可直接磷酸化激活p53。當活化的p53蛋白積累到一定水平時，可轉錄激活促凋亡基因，如Bax、Caspse 9及Caspse 3，也可轉錄抑制抗凋亡基因，如Bcl-2，誘導線粒體途徑和死亡受體途徑的細胞凋亡[18]。而靶點HSP90AA1作為伴侶蛋白，從上面的分析知道，被大黃關鍵成分抑制后可阻止p53信號通路泛素化降解，抑制AP發展。

綜上所知，大黃的beta-sitosterol等核心活性成分可通過HSP90AA1等疾病靶點干預p53信號通路，抑制細胞凋亡等過程，緩解AP的炎癥反應。同時受有毒物質、非生物刺激、氧氣水平等生物過程影響。